陳建軍，張華杰，劉娜娜

(河南師范大學生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

迅速增長的水產(chǎn)養(yǎng)殖使得水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，導致水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病頻發(fā)[1].而水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病治療所依賴的抗生素已經(jīng)受到限制，并且抗生素的濫用也導致耐藥菌株的出現(xiàn)，不僅對魚類和人類健康產(chǎn)生不利影響，而且對水生環(huán)境也造成了嚴重的破壞[2-3].近三十多年來，抗生素的使用在養(yǎng)殖業(yè)中受到了很大的限制或者禁用，因此研究抗生素的替代品成為熱點.通過多年研究，國內(nèi)外普遍認可的能夠代替或減少抗生素使用的飼料添加劑有益生菌、中草藥等.益生菌可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和消化酶活性提高宿主動物的生長性能和抗病性.在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，記錄最多的益生菌包括乳酸菌，芽孢桿菌屬和酵母菌.中草藥是天然藥物添加劑，含多種生物有效活性物質(zhì)成分，有研究已證明了中草藥在治療水產(chǎn)動物的細菌性疾病有極好的效果[4].艾草中揮發(fā)性油類、黃酮類、三萜類等物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[5-6]；構樹葉中粗蛋白質(zhì)含量較高，常用于飼料添加以補充蛋白量，構樹葉中含多種氨基酸，具有抗氧化抗腫瘤等作用，能夠提高動物的免疫力[7].這2種中草藥已在畜禽養(yǎng)殖中廣泛應用，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中還未見報道[8].

益生菌和中草藥作為飼料添加劑，在改善水產(chǎn)動物的生長性能和健康狀況方面取得了顯著的成果[9-11].很多研究者分別研究了益生菌和中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的機理.這2種添加劑的聯(lián)合應用卻很少受到關注.益生菌和中草藥聯(lián)合制劑即發(fā)酵中草藥在畜禽養(yǎng)殖中已有應用，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中卻很少報道.本試驗首次研究飼料中添加益生菌發(fā)酵艾草構樹葉混合物對鯉魚免疫性能的影響，以期為發(fā)酵艾草構樹葉在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用益生菌菌株(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、屎腸球菌)均由河南師范大學生命科學學院微生物實驗室提供；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基所用試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉(NaCl)、酵母浸粉、可溶性淀粉((C6H10O5)n)、乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)、檸檬酸銨(C6H5O7- (NH4)3)，磷酸氫二鉀(K2HPO4)、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、一水硫酸錳(MnSO4·H2O)均為分析純； 基礎飼料購自河南大德農(nóng)牧科技有限公司(營養(yǎng)水平為干物質(zhì)88.71%，粗蛋白32.52%，粗脂肪為7.24%，粗灰分10.52%)；參照先前研究選擇益生菌濃度為1×108CFU/g，發(fā)酵艾草構樹葉混合物添加比例為0.4%[9,12-13].在基礎飼料中添加益生菌(枯草芽孢桿菌∶地衣芽孢桿菌∶保加利亞乳桿菌∶屎腸球菌=1∶1∶1∶1)、艾草構樹葉混合物(艾草∶構樹葉=1∶1)和發(fā)酵艾草構樹葉混合物分別制成益生菌飼料(A)、艾草構樹葉混合物飼料(B)和發(fā)酵艾草構樹葉混合物飼料(C)備用.

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組及免疫方案 鯉魚從河南省新鄉(xiāng)市延津某魚場購買，并轉移到水產(chǎn)學院溫室養(yǎng)殖基地并將所有魚用高錳酸鉀浴處理，以每缸15條魚，體質(zhì)量為(50±3)g，放到12個80 L水缸中(持續(xù)1周)以適應環(huán)境.試驗根據(jù)飼喂飼料不同設為4組(每組3缸)：對照組、益生菌組、艾草構樹葉混合物組和發(fā)酵艾草構樹葉混合物組，具體分組如表1所示.飼喂30 d后進行樣品采集并在每組中隨機選擇30條鯉魚(每缸10條)進行嗜水氣單胞菌(2.51×108CFU/g)腹腔注射(1 mL/100 g)并統(tǒng)計成活率.

1.2.2 樣品采集 每個試驗組隨機選取6條(每缸2條)進行心臟采血，并將其轉移至無菌PE管中，4 ℃靜置4 h，3 500 r/min離心10 min，吸取上清轉移至新的無菌管中并保存于4 ℃，檢測酶活待用.使用無菌剪和鑷子取出脾臟保存于-80 ℃冰箱中待進行總RNA的提取和RT-PCR檢測分析使用.

1.2.3 酶活力檢測 檢測血清中免疫相關的酶活所使涉及到的超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)及溶菌酶(LZM)均按照南京建成生物有限公司商用試劑盒說明書進行操作.

1.2.4 熒光定量檢測 使用RNAiso Plus(TaKaRa，中國)裂解勻漿組織細胞提取總RNA，定量用分光光度法評估純度，并用cDNA反轉錄試劑盒(TaKaRa，中國)反轉錄成cDNA.使用羅氏 LightCycler 96 PCR儀通過實時PCR分析免疫基因IL-6、IL-10、TNF-α、LZM的表達，總體積為10 μL，包含SYBR Fast qPCR Mix(TaKaRa，中國)，特殊引物(5 μL)，cDNA和無菌雙蒸餾水.程序是在95 ℃下持續(xù)600 s，然后執(zhí)行45個循環(huán)，分別是95 ℃下15 s和60 ℃下60 s.在擴增階段之后進行熔解曲線以確認.每個樣品重復3次.40 s rRNA作為內(nèi)參基因.使用2-ΔΔCT方法研究了脾臟中免疫基因的相對表達水平.用于基因分析的引物序列見表2.

1.3 數(shù)據(jù)處理

表1 試驗設計與分組

2 結果與分析

2.1 非特異性免疫反應

與對照組相比，添加劑各組鯉魚血清中AKP和ACP酶活性組升高，其中，添加劑組AKP顯著升高，且各組間無顯著差別(P>0.05)；艾草構樹葉混合物組和發(fā)酵艾草構樹葉混合物組ACP顯著升高(P<0.05).而對于溶菌酶，添加劑組相較于對照組雖有升高但不顯著(P>0.05).結果表明添加劑組的鯉魚相對于對照組免疫力提高，如圖 1所示.

添加益生菌和發(fā)酵艾草構樹葉混合物組的髓過氧化物酶比對照組顯著升高(P<0.05)，而SOD酶活在各添加劑組中沒有顯著性變化(P>0.05)，說明血清中抗氧化能力有所改善，如圖2所示.

表2 引物序列

圖1 飼喂30 d后鯉魚血清中AKP、ACP、LZM活性Figure 1 AKP,ACP,LZM activities in carp serum after 30 days of feeding

圖2 飼喂30 d后鯉魚血清中SOD、MPO活性Figure 2 SOD and MPO activities in carp serum after 30 days of feeding

2.2 免疫相關的基因在脾臟中的表達

如圖3所示，IL-10在脾臟中，添加劑組均高于對照組，其中益生菌組和發(fā)酵艾草構樹葉混合物組顯著高于對照組和艾草構樹葉混合物組(P<0.05)，而與之相反的是IL-6在脾臟中的表達量添加劑組均降低，且益生菌組和發(fā)酵艾草構樹葉混合物組顯著低于對照組和艾草構樹葉混合物組(P<0.05).而TNF-α在脾臟中的表達與IL-6相似，這種結果可能與益生菌有關.

溶菌酶在脾臟中的表達結果表明，添加劑組均顯著高于對照組(P<0.05)，且添加劑組間存在顯著差異性，益生菌組>發(fā)酵艾草構樹葉混合物組>艾草構樹葉混合物組(圖4).這種結果可能與益生菌分泌抗菌肽等活性酶有關，艾草構樹葉混合物中含有的生物活性物質(zhì)對抗原也有一定的作用.

圖3 IL-10、IL-6、TNF-α在脾臟中的表達Figure 3 IL-10,IL-6,TNF-α expression in the spleen

圖4 LZM在脾臟中的表達Figure 4 Lysozyme expression in the spleen

2.3 抗病性檢測

用嗜水氣單胞菌攻擊鯉魚統(tǒng)計10 d內(nèi)的存活率如圖5所示.對照組在第2天觀察到魚死亡，在注射后第3天對照組、益生菌組及艾草構樹葉混合物組出現(xiàn)死亡.在注射第5天后各組無死亡出現(xiàn).在10 d的攻擊試驗結束時，飼喂益生菌、艾草構樹葉混合物和發(fā)酵艾草構樹葉混合物的魚的累積存活率均高于飼喂基礎飼料的魚，結果如圖5所示.

3 討論

人們?yōu)榱嗽谟邢蘅臻g內(nèi)擴大水產(chǎn)養(yǎng)殖，增加收入，頻繁使用抗生素以提高水產(chǎn)動物的免疫性能，而現(xiàn)在抗生素逐漸禁用或限制之后，具有提高免疫力的替代飼料添加劑就受到了特別關注.因此，益生菌和中藥的組合已顯示適合于此目的.本次試驗研究結果顯示在飼喂30 d后，添加劑組非特異性免疫要優(yōu)于對照組.非特異免疫是魚類免疫的第一道防線[14].堿性磷酸酶(AKP)、堿性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LZM)等屬于非特異免疫酶，在對外來抗原的識別、清除以及調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡具有重要作用，是非特異性免疫性能的重要指標.試驗結果中溶菌酶(LZM)無顯著變化可能是未受到細菌性抗原的刺激，而添加劑組堿性磷酸酶(AKP)和堿性磷酸酶(ACP)酶活顯著高于對照組，可能是饑餓24 h以及采血過程中使鯉魚產(chǎn)生應激反應，使得添加劑組中的鯉魚快速激活堿性磷酸酶(AKP)和堿性磷酸酶(ACP).韓永峰等[15]采用甘草和復方五倍子飼喂黃河鯉12 d后，使用嗜水氣單胞菌攻擊黃河鯉，檢測結果也顯示了處理組的堿性磷酸酶(AKP)和堿性磷酸酶(ACP)酶活顯著高于對照組，溶菌酶也顯著升高.蘇嶺等[16]用復方中藥熬汁每天灌服鯉魚，在接受細菌性抗原刺激后AH組魚的堿性磷酸酶 (AKP)含量顯著升高.這與本試驗結果相一致.由此可以證明添加益生菌、艾草構樹葉混合物及發(fā)酵艾草構樹葉混合物可以顯著提高鯉魚的非特異性免疫反應.

圖5 嗜水氣單胞菌攻擊鯉魚后10 d內(nèi)的成活率Figure 5 The survival rate within 10 days after Aeromonas hydrophila challenged carps

關于添加益生菌、艾草構樹葉混合物和發(fā)酵艾草構樹葉混合物對鯉魚抗氧化能力的影響，本試驗中添加益生菌和發(fā)酵艾草構樹葉混合物組的髓過氧化物酶(MPO)的活性則顯著高于對照組.這可能是益生菌和發(fā)酵艾草構樹葉混合物內(nèi)一些中藥降解產(chǎn)物在一定程度上提高了鯉魚的非特異性免疫機能.此外，MPO是中性粒細胞的功能及激活標志，其主要功能是利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基，對機體產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥反應等多方面發(fā)揮作用[17].Seunghan等[18]在日本鰻魚日糧中添加益生菌和益生元飼喂8周后檢測到血清中髓過氧化物酶(MPO)比對照組顯著升高，這與本試驗結果一致；而對于超氧化物歧化酶(SOD)結果也類似，雖有升高但相較于對照組并不顯著.謝炎福用0.1%的益生菌發(fā)酵復方中藥飼喂黃河鯉檢測到超氧化物歧化酶(SOD)結果和本試驗結果相似[9]，而0.3%的益生菌發(fā)酵復方中藥組比對照組顯著升高.由以上可以推斷可能是本試驗中益生菌添加量過低，不足于對機體SOD活力產(chǎn)生顯著影響.本試驗結果表明，在飼料中添加益生菌、艾草構樹葉混合物、發(fā)酵艾草構樹葉混合物對鯉魚抗氧化能力有一定影響.

魚類的脾臟中含有大量淋巴細胞，與魚類的體液免疫即特異性免疫密切相關，僅次于頭腎[19]；而之前研究通常以頭腎研究為主，而對脾臟的研究很少[20].本試驗對添加發(fā)酵艾草構樹葉混合物對鯉魚脾臟中免疫相關基因進行了初步探究，結果發(fā)現(xiàn)益生菌和發(fā)酵艾草構樹葉混合物組中溶菌酶比艾草構樹葉混合物組顯著升高可能是益生菌分泌酶類產(chǎn)物使得溶菌酶表達水平升高，中藥中含有的黃酮類物質(zhì)具有一定的抑菌殺菌作用但未經(jīng)過發(fā)酵某些成分無法發(fā)揮作用.益生菌組和發(fā)酵艾草構樹葉混合物組比另外兩組的IL-10基因表達水平顯著升高，IL-6和TNF-α的表達水平則相反.可能是溶菌酶已將有害物溶解或殺死，巨噬細胞未被激活，因此促炎因子IL-6和TNF-α表達被抑制，相反，抑炎因子IL-10表達升高.中藥組可能是未發(fā)酵的中藥中含有某些能夠被益生菌降解的物質(zhì)對鯉魚有一定的毒性作用引起了巨噬細胞的激活.鯉魚抗嗜水氣單胞菌挑戰(zhàn)試驗中發(fā)酵中藥組成活率最高，其次是益生菌和艾草構樹葉混合物組，對照組最低，這一結果也證明了酶活和基因表達變化結果.

4 結論

在飼料中添加益生菌、艾草構樹葉混合物和發(fā)酵艾草構樹葉混合物能夠顯著鯉魚的免疫性能，且發(fā)酵艾草構樹葉混合物效果最優(yōu).