薛向東，吳迎爽，馬君，程淵博，王利紅，韓露

（張家口市第一醫(yī)院，河北 張家口 075000）

支氣管哮喘是兒童最常見的氣道慢性、過敏性、炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制仍不清楚，增加了臨床診治的難度，臨床急需尋找一種有效的生物標(biāo)志物用于指導(dǎo)診治。近年來越來越多的研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）這一類不具有蛋白編碼功能的核苷酸，在過敏性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，與其參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過程有關(guān)[1-2]。與此同時，遺傳因素成為近年來國內(nèi)外學(xué)者研究患兒支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的重點(diǎn)，其中漿細(xì)胞瘤多樣性異位基因1（PVT1）所編碼的lncRNA，即lncRNA PVT1 介導(dǎo)小兒支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，可能是該病的特異性標(biāo)志物[3]。在體外實驗中，JIE 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松處理人類平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PVT1 表達(dá)水平隨之升高，提示lncRNA PVT1 可能參與維持平滑肌細(xì)胞表型。宋繼波等[5]復(fù)制大鼠哮喘模型后，發(fā)現(xiàn)造模組lncRNA PVT1表達(dá)水平高于對照組。lncRNA PVT1 在患兒支氣管哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，然而表達(dá)意義仍不十分明確，尚未形成統(tǒng)一定論，是否與炎癥因子有關(guān)有待明確。本研究分析支氣管哮喘患兒lncRNA PVT1的表達(dá)及與炎癥因子的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2019年12月張家口市第一醫(yī)院收治的60 例支氣管哮喘患兒作為觀察組。其中，男性34 例，女性26 例；年齡3 ～11 歲，平均（6.58±2.37）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①病情處于急性發(fā)作期；②符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[6]；③經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①合并先天性心臟病、胸廓病變及免疫功能異常；②長期服用激素或免疫調(diào)節(jié)劑；③已接受?？浦委?。另選同期本院健康體檢兒童60 例作為對照組。其中，男性30 例，女性30 例；年齡3 ～11 歲，平均（6.82±2.44）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要實驗試劑及儀器

總RNA 提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國GeneCopoeia 公司），白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）試劑盒均購自上海瑞番生物科技有限公司。680 型全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

所有受試者入組后，采集清晨空腹肘靜脈血5 ml，2 000 r/min 離心分離血清，放置-80℃冰箱待測。按Trizol 法使用總RNA 提取試劑盒提取總血清RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cRNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測lncRNA PVT1 表達(dá)水平。

收集支氣管哮喘患兒和健康體檢兒童的氣管平滑肌細(xì)胞各60 例，并進(jìn)行原代培養(yǎng)，使用PCR檢測lncRNA PVT1 表達(dá)水平。正向引物序列： 5'-AATCCTTTATGTGACCAGAA-3'；反向引物序列： 5'-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3'，長度20 bp；總反應(yīng)體系為Mix 10μl，正反向引物各0.8μl，cDNA 2μl，DEPC 水6.4μl；反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，50℃延伸10 s，共計45 個循環(huán)。

運(yùn)用RNA 過表達(dá)技術(shù)對對照組原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA PVT1 過表達(dá)，分別收集對照組過表達(dá)lncRNA PVT1 前后和觀察組siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測原代培養(yǎng)細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)水平，包括IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 觀察指標(biāo)

比較觀察組與對照組血清及原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 表達(dá)水平。觀察對照組過表達(dá)lncRNA PVT1 前后和觀察組siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后原代培養(yǎng)細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)水平變化，使用Pearson 法分析不同變量的相關(guān)性，使用受試者工作特征（receiver operating curve,ROC）曲線下面積（area under the curve,AUC）評價血清lncRNA PVT1 對支氣管哮喘患兒的診斷效能。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Pearson 法，繪制ROC 曲線，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清及原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 表達(dá)水平比較

對照組與觀察組血清及原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組高于對照組。見表1。

2.2 對照組過表達(dá)lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平比較

對照組過表達(dá)lncRNA PVT1 前后原代培養(yǎng)細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過表達(dá)后高于過表達(dá)前。見表2。

表1 兩組血清及原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 表達(dá)水平比較 （n =60，±s）

表1 兩組血清及原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 表達(dá)水平比較 （n =60，±s）

組別 血清 原代培養(yǎng)細(xì)胞對照組 0.68±0.26 2.62±0.57觀察組 2.85±0.73 13.26±2.84 t 值 5.623 12.045 P 值 0.027 0.000

表2 對照組過表達(dá)lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平比較 （n =60，pg/ml，±s）

表2 對照組過表達(dá)lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平比較 （n =60，pg/ml，±s）

時間 IL-1β IL-6 IL-10 TNF-α過表達(dá)前 0.35±0.12 4.15±1.26 2.12±0.47 2.87±0.67過表達(dá)后 9.62±2.54 42.26±4.71 15.84±2.95 17.41±2.38 t 值 6.528 13.045 8.745 6.364 P 值 0.012 0.000 0.000 0.018

2.3 觀察組siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平比較

觀察組siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后原代培養(yǎng)細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），沉默后低于沉默前。見表3。

表3 觀察組siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平比較 （n =60，pg/ml，±s）

表3 觀察組siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平比較 （n =60，pg/ml，±s）

時間 IL-1β IL-6 IL-10 TNF-α沉默前 13.84±3.87 58.42±6.38 20.36±4.85 25.47±4.62沉默后 1.06±0.43 4.87±3.91 4.58±1.09 3.62±1.36 t 值 8.424 17.242 12.262 8.942 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 兩組lncRNA PVT1 過表達(dá)前后或siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平的差值比較

對照組lncRNA PVT1 過表達(dá)前后與觀察組siRNA沉默lncRNA PVT1 前后原代培養(yǎng)細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-10 及TNF-α 表達(dá)水平的差值比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

2.5 原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 與IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 法分析，原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1與IL-1β、IL-6、IL-10 及TNF-α 表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.225、0.587、0.281 和0.312，P=0.026、0.000、0.021 和0.013）。見圖1。

表4 兩組lncRNA PVT1 過表達(dá)前后或siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平的差值比較（n =60，pg/ml，±s）

表4 兩組lncRNA PVT1 過表達(dá)前后或siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎癥因子表達(dá)水平的差值比較（n =60，pg/ml，±s）

組別 IL-1β IL-6 IL-10 TNF-α對照組 9.64±2.48 38.45±3.16 13.58±2.68 16.87±3.24觀察組 11.07±3.03 46.28±2.98 15.47±2.06 20.16±1.99 t 值 0.879 1.245 0.815 1.364 P 值 0.120 0.087 0.184 0.079

圖1 原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 與IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表達(dá)水平相關(guān)性的散點(diǎn)圖

2.6 血清lncRNA PVT1 診斷支氣管哮喘患兒的效能分析

經(jīng)ROC 曲線分析，血清lncRNA PVT1 診斷支氣管哮喘患兒的AUC 為0.917（95% CI： 93.260，100.000），標(biāo)準(zhǔn)誤為0.074，敏感性為75.48%（95% CI： 0.856，0.954），特異性為94.03%（95% CI： 0.934，0.974）。見圖2。

圖2 lncRNA PVT1 診斷支氣管哮喘患兒的ROC 曲線

3 討論

患兒支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展與氣道慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，然而具體發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，不利于該病的臨床診治。近年來，遺傳因素成為國內(nèi)外學(xué)者研究患兒支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的重點(diǎn)，認(rèn)為氣道平滑肌可能在患兒發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。尋找與支氣管哮喘患兒氣道平滑肌密切相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物，有望在解釋患兒支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制上取得顯著進(jìn)展，指導(dǎo)臨床診治。國外最新研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1 不僅參與多種惡性腫瘤的形成，而且可調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)[7]。WANG 等[8]研究顯示，平滑肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PVT1 是維持平滑肌細(xì)胞表型的關(guān)鍵所在。AUSTIN 等[9]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，哮喘組大鼠血清及平滑肌原代培養(yǎng)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PVT1 表達(dá)水平高于對照組。上述研究均提示，lncRNA PVT1 在患兒支氣管哮喘發(fā)病過程中的調(diào)控作用[8-9]。本研究中，觀察組血清及原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 表達(dá)水平高于對照組，與YANG 等[10]的研究結(jié)果相似，提示lncRNA PVT1 在支氣管哮喘患兒中表達(dá)水平較高，究其原因，考慮為lncRNA PVT1 是一種患兒支氣管哮喘遺傳易感基因，其是否與細(xì)胞因子水平有關(guān)，有待商榷。也有研究顯示，支氣管哮喘患兒血清lncRNA PVT1 表達(dá)水平并未較健康體檢兒童升高[11]，與本研究結(jié)果不同，這可能與血清lncRNA PVT1 表達(dá)水平受患兒特應(yīng)性體質(zhì)和氣道炎癥反應(yīng)影響有關(guān)。

現(xiàn)代哮喘理論認(rèn)為，患兒支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展有賴于Th1/Th2 細(xì)胞免疫失衡所導(dǎo)致的炎癥因子高水平表達(dá)來實現(xiàn)[12]。炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 可能是導(dǎo)致患兒支氣管哮喘癥狀出現(xiàn)的直接因素[13]。觀察組siRNA 沉默lncRNA PVT1 后，原代培養(yǎng)細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表達(dá)水平較沉默前降低，與代冰等[14]研究證實支氣管哮喘患者平滑肌細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 等炎癥因子表達(dá)水平升高的這一結(jié)論相符，提示患兒支氣管哮喘與氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)，這可能與免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果結(jié)合筆者臨床經(jīng)驗，推測支氣管哮喘患兒炎癥因子表達(dá)水平可能與lncRNA PVT1有關(guān)。為驗證上述觀點(diǎn)，本研究運(yùn)用RNA 過表達(dá)技術(shù)對對照組原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA PVT1 過表達(dá)，結(jié)果顯示對照組過表達(dá)lncRNA PVT1 后，原代培養(yǎng)細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表達(dá)水平較過表達(dá)前升高；與此同時，對照組過表達(dá)前后與觀察組siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后原代培養(yǎng)細(xì)胞中各炎癥因子表達(dá)水平的差值比較無差異。由此可見，支氣管哮喘患兒氣道平滑肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PVT1 是調(diào)控炎癥因子水平的重要因素，兩者可能存在某種特定關(guān)系。關(guān)于出現(xiàn)上述結(jié)果的原因，考慮如下： lncRNA PVT1可調(diào)控T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響炎癥因子的分泌和釋放[8]，是否僅局限于氣道平滑肌，還有待驗證。

對于患兒支氣管哮喘，分析原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 表達(dá)水平與炎癥因子的關(guān)系，有助于支持lncRNA PVT1 調(diào)控炎癥反應(yīng)的這一觀點(diǎn)。紀(jì)易斐等[15]研究認(rèn)為，lncRNA PVT1 通過促進(jìn)支氣管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而上調(diào)炎癥因子水平。也有研究顯示，lncRNA PVT1 不僅促進(jìn)支氣管平滑肌細(xì)胞表達(dá)和分泌炎癥因子，而且通過炎癥因子誘導(dǎo)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，參與患兒的氣道重構(gòu)[16-17]。lncRNA PVT1如何調(diào)控支氣管哮喘患兒炎癥因子表達(dá)和分泌，值得臨床學(xué)者深入探討。但在本研究中，筆者通過Pearson法分析，結(jié)果顯示支氣管哮喘患兒氣道平滑肌原代培養(yǎng)細(xì)胞lncRNA PVT1 表達(dá)水平與IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示lncRNA PVT1 可能是患兒支氣管哮喘的生物標(biāo)志物，反映炎癥反應(yīng)程度。鑒于支氣管哮喘患兒血清lncRNA PVT1 主要來源于氣道平滑肌細(xì)胞，檢測血清lncRNA PVT1 水平，可能為臨床診治支氣管哮喘患兒提供依據(jù)[18]。本研究的ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清lncRNA PVT1 診斷患兒支氣管哮喘的AUC 為0.917，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.074，敏感性為75.48%，特異性為94.03%，有效說明了檢測血清lncRNA PVT1 水平診斷支氣管哮喘患兒的效能較好。

綜上所述，支氣管哮喘患兒lncRNA PVT1 高水平表達(dá)，與炎癥因子水平呈正相關(guān)，對該病的診斷效能較好，值得臨床予以重視。本研究創(chuàng)新點(diǎn)在于初步證實lncRNA PVT1 具有調(diào)控支氣管哮喘患兒氣道炎癥反應(yīng)的作用，為研究患兒支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制提供了新方向。當(dāng)然本研究亦存在不足之處，如采取單中心研究，樣本量不多，缺乏后續(xù)診療數(shù)據(jù)，未能分析血清lncRNA PVT1 對患兒支氣管哮喘治療的指導(dǎo)意義，有待日后擴(kuò)大研究規(guī)模，增加樣本量，深入分析血清lncRNA PVT1 表達(dá)水平與患兒支氣管哮喘病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，以及在該病診療中的臨床價值。