王海霞 康顯杰 朱燕 來平凡 周燕紅 楊瑩

1.杭州市丁橋醫(yī)院 杭州 310021 2.浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司 3.浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院4.浙江中醫(yī)藥大學

白術是菊科蒼術屬多年生草本植物白術（A-tractylodes macrocephala Koidz.）的干燥塊莖，味苦、甘，性溫，歸脾、胃經，有扶植脾胃、燥濕利水、消食除痞、止汗、安胎之功效[1-2]。白術的主要化學成分為倍半萜、三萜、苯丙素、黃酮、多糖、聚炔等，包括白術內酯、白術多糖及聚炔類化合物[3]。據文獻報道，白術提取物能通過促進大鼠上皮細胞遷移、改善腸道菌群結構、抑制腸道痙攣等，并能改善腸胃功能[4]，還可以通過抑制炎癥因子釋放、抑制脂質過氧化以及血管生成等發(fā)揮抗炎活性[5]。在臨床上，白術常被用于腸道炎癥的治療，且療效顯著[6]。然而，白術治療腸道炎癥作用的機制尚不明確。

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是慢性炎癥性腸病的一種，其病因及發(fā)病機制尚不明確，主要病理改變?yōu)橹蹦c和結腸淺表性、非特異性并呈彌漫性分布的炎癥病變，以腹痛、腹瀉、排膿血便等為主要臨床癥狀[7]。UC屬于難治性疾病，病程反復遷延，臨床上多采用柳氮磺吡啶（sulfasalazine，SASP）、糖皮質激素、免疫抑制劑進行治療[8]。這些常用藥物雖有一定效果，但也常因價格昂貴、副作用較大等因素影響患者持續(xù)治療。目前研究發(fā)現，白術與多種中藥配伍可顯著緩解UC癥狀，提示白術在UC治療中具有重要意義[9]，但由于白術組成復雜，疾病相關靶點通路繁多，導致其作用機制尚不明確。因此，本研究擬采用網絡藥理學的方法，構建“成分-靶點-通路”網絡，預測其具體作用靶點和可能的信號通路，為進一步闡明其治療UC的分子機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 數據庫及軟件 中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TraditionalChinese Medicines Systems Pharmacology Database，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、臺灣中醫(yī)藥資料數據庫（Traditional Chinese Medicine Database@ Taiwan） （http：//tcm.cmu.edu.tw/）、ChemicalBook （https：//m.chemicalbook.com/）、PubChem（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）、SwissADME （http：//www.swissadme.ch/）、SuperPred （http：//prediction.charite.de/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、藥物靶標數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards （https：//www.genecards.org/）、U-niprot （https：//www.uniprot.org/）、DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）、ChemOffice 15.0、PyMOL、Auto Dock、Cytoscape 3.6.1。

1.2 白術活性成分及成分靶點預測結果的篩選 通過TCMSP數據庫[10]、臺灣中醫(yī)藥資料數據庫[11]及Pubmed文獻數據庫檢索近5年內相關文獻，獲得白術活性成分，使用PubChem和ChemicalBook平臺對其分子結構進行確認，并獲取其SDF格式文件及對應的簡化分子線性輸入規(guī)范 （simplified molecular input line entry specification，SMILES）結構，用于類藥性預測，通過SwissADME預測各化合物是否符合Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge規(guī)則[12]。 如果化合物違背上述規(guī)則，需結合文獻調研進一步篩選，獲得白術活性成分。將篩選獲得的白術活性成分的數據文件，按TCMSP、Swiss TargetPrediction、SuperPred各數據庫的要求，設定概率值＞0.5，綜合預測各活性成分所對應的潛在作用靶點。

1.3 白術活性成分-潛在靶點網絡構建及疾病靶點的篩選 將上述白術活性成分及相關靶點，上傳至Cytoscape 3.6.1軟件，進行白術活性成分-靶點網絡的構建。 通 過DisGeNET[13]、TTD[14]、GeneCards[15]數 據庫，輸入關鍵詞檢測“Ulcerative Colitis”，物種設置為Homo sapiens（Human），查找分析和UC相關的人類基因，根據各數據庫篩選條件篩選，去除重復值并查閱相關文獻進行驗證，最終獲得UC相關靶點。

1.4 成分靶點與疾病靶點標準化及蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI）的構建 利用U-niprot數據庫，上傳白術活性成分潛在作用靶點及UC相關靶點名稱（target name），蛋白種屬設置為“Homo sapiens（Human）”，獲取篩選所得到的全部靶點的標準基因名稱。為明確白術與UC的關系，將上述標準化后的靶點輸入Venny 2.1軟件繪制韋恩圖，并獲得成分與疾病共有靶點。再將共有靶點信息輸入Cytoscape 3.6.1軟件的BisoGenet插件中，在Identifiers條目下選擇 “Homo sapiens（Human）”“Gene identifiers only”，在Data Settings條目下選擇 “Protein Protein Interaction”[16]，分析后形成成分-疾病靶點PPI網絡。

1.5 PPI網絡的拓撲分析及核心靶點的獲取 對成分-疾病靶點PPI網絡進行功能分析，在Cytoscape 3.6.1軟件中點擊 “Tools-Network Analyzer-Network Analysis-Analyze Network”，并進一步使用該軟件中的CytoNCA插件進行拓撲分析，導出分析結果，文件格式為csv，以度值（degree）中位數的2倍為最小值，對成分-疾病靶點PPI網絡的核心靶點進行篩選，多次篩選后獲得成分-疾病靶點核心PPI網絡[17]。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）生物進程分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析 將上述篩選所得的疾病核心靶點導入DAVID 6.8數據庫[18]中，選定標識符為“OFFICE_GENE_SYMBOL”，列表類型為“Gene List”；選定物種為“Homo sapiens（Human）”，選用“Functional Annotation Chart”功能注釋工具，并在Gene_Ontology和Pathways中選定 GOTERM_BP_DIRECT和KEGG_PATHWAY進行GO生物進程的富集分析和KEGG通路富集分析[19]。根據P＜0.05篩選富集分析結果，并以P值作為參數，應用GraphPad Prism 7使富集結果可視化。

1.7 成分-靶點分子對接 采用ChemOffice軟件修飾上述獲取的成分SDF格式文件并使其結構能量最小。從PDB數據庫下載疾病靶點蛋白3D結構的PDB格式文件，并運用PyMOL軟件對蛋白質分子進行去水、加氫等操作，利用Auto Dock軟件將化合物及靶點蛋白轉化成備用對接文件格式（pdbqt格式），以Vina進行分子對接。通過結合能（binding energy，BE）對成分與靶點之間的結合活性進行評價，最后運用PyMOL軟件使對接文件可視化。

2 結果

2.1 白術相關活性成分與靶點預測 經數據庫及文獻檢索，獲取白術93種化學成分，通過SwissADME數據庫上傳93種化學成分的SMILES結構進行預測，并進行文獻調研，最終獲得11種白術潛在活性成分，以M1～M11命名。見表1。綜合預測所有活性成分的潛在作用靶點，共得到144個潛在作用靶點，包括腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）、G1/S-特異性細胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1）、胰蛋白酶-1（trypsin-1）、鈣調素（calmodulin）等。

表1 白術11種活性成分結構及命名Tab.1 Structure and nomenclature of 11 active components of Atractylodes macrocephala

2.2 白術活性成分-潛在靶點網絡構建 將白術11種活性成分及144個潛在靶點信息上傳至Cytoscape 3.6.1軟件中，得到白術活性成分-潛在靶點可視網絡圖，其中方形代表活性成分，圓形代表潛在靶點，共得到156個節(jié)點、222條邊。見圖1。

2.3 UC相關靶點的篩選 在DisGeNET、TTD、GeneCards數據庫中，以疾病名稱“Ulcerative Colitis”進行檢索，其中DisGeNET數據庫篩選得到62個疾病靶點，TTD數據庫篩選得到39個疾病靶點，GeneCards數據庫篩選得到109個疾病靶點，將所得所有疾病靶點去除重復項后獲得147個UC相關靶點，包括自噬相關蛋白16-1（autophagy-related protein 16-1，ATG16-1）、CC趨化因子受體6（CC chemokine receptor6，CCR6）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等。

圖1 白術活性成分-潛在靶點網絡Fig.1 Active ingredient-potential target network of Atractylodes macrocephala

2.4 成分靶點與疾病靶點標準化 通過Uniprot數據庫將上述白術及UC靶點標準化為基因名，并將所得基因名輸入Venny 2.1軟件繪制靶點韋恩圖。見圖2。其中白術與UC共有靶點23個，主要涉及蘇氨酸蛋白激酶1（threonine protein kinase 1，AKT1）、半胱天冬酶3（caspase 3，CASP3）、IL-10、干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）、 前列腺素G/H合酶1 （prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1）、 細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1）等。

圖2 藥物靶點-疾病靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of targets of medicine and disease

2.5 PPI網絡的構建及拓撲分析 為進一步探究白術對UC的藥理機制，將上述獲得的共有靶點導入Cytoscape 3.6.1軟件的BisoGenet插件中，根據“1.3”所述條件進行網絡分析，獲得由1 963個節(jié)點、45 115條邊組成的PPI網絡，以degree中位數的2倍為最小值進行2次篩選，依次獲得由507個節(jié)點、19 145條邊和由58個節(jié)點、712條邊組成的PPI網絡。見圖3。導出最終篩選所得的58個節(jié)點信息，即為PPI網絡核心靶點。

圖3 PPI網絡拓撲分析Fig.3 Network topology analysis of PPI

2.6 GO生物進程和KEGG通路富集分析 將“2.5”項獲取的PPI網絡核心靶點上傳至DAVID 6.8數據庫中進行GO生物過程及KEGG信號通路富集分析。GO生物進程富集分析共獲得188個條目，設定錯誤發(fā)生率（false discovery rate，FDR）≤0.05， 篩選后獲得30個相關條目，根據P值排列，前20位的GO生物進程條目主要包括基因沉默調控（regulation of gene silencing）、端粒組織（telomere organization）、DNA復制依賴性核小體組裝（DNA replication-dependent nucleosome assembly）、rDNA染色質沉默（chromatin silencing at rDNA）等。見表2。KEGG信號通路富集分析獲得48條信號通路，根據P值排列獲取前20的信號通路，并用GraphPad Prism 7對富集通路的靶點數及P值進行可視化。見圖4。提示白術可能通過癌癥中的轉錄失調（transcriptional misregulation in cancer）、癌癥途徑（pathways in cancer）、前列腺癌（prostate cancer）、細胞周期（cell cycle）、酗酒（alcoholism）等信號通路發(fā)揮治療UC的作用。

表2 核心靶點GO生物進程分析Tab.2 Entry of GO biological process analysis in core targets

圖4 KEGG信號通路可視化結果Fig.4 Visualization results of KEGG signaling pathway

2.7 白術有效成分 將白術作用靶點較多的有效成分木犀草素（luteolin）、芹菜素（apigenin）與疾病核心靶點degree值前3位的p53蛋白、神經生長因子受體酪氨酸激酶（tyrosine kinase A，TrkA）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）進行分子對接結合，結果如表3所示，提示木犀草素、芹菜素與p53、TrkA、ER1均存在穩(wěn)點對接結構，部分結果見圖5。

表3 白術部分核心靶點與疾病核心靶點分子對接結合能（kJ·mol-1）Tab.3 Molecular docking binding energy of some core targets of Atractylodes macrocephala and disease core targets（kJ·mol-1）

3 討論

白術是中醫(yī)臨床常用中藥之一，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，臨床主要用于治療消化性潰瘍、腸易激綜合征、炎癥性腸病等疾病?，F代研究表明，白術主要含有內酯類、多糖類等成分[20]。UC是一種可由免疫調節(jié)異常、腸黏膜腸胃功能障礙等因素引起慢性炎癥性腸病，而白術具有調節(jié)胃腸功能、抗炎及調節(jié)免疫等作用，臨床常用于UC的治療[9]。本研究運用網絡藥理學相關技術，整合文獻資料，分析白術治療UC潛在作用靶點，構建白術治療UC潛在作用靶點的交互網絡，富集相關生物進程及信號通路，闡述并驗證了白術治療UC的潛在分子作用機制，為白術臨床治療及產品開發(fā)提供可靠的科學依據。

網絡藥理學分析結果顯示，白術的主要活性成分包括白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、木犀草素、5-羥基阿魏酸、芹菜素等。有研究表明，白術內酯Ⅰ、Ⅲ能夠通過抑制一氧化氮的產生，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6及血管內皮生長因子活性，從而發(fā)揮抗炎作用[21]。芹菜素可通過抑制炎癥小體信號通路治療右旋糖酐硫酸鈉誘導的小鼠慢性結腸炎[22]。木犀草素通過降低Th1、Th2和Th17細胞比例和髓過氧化酶（myeloperoxidase，MPO）水平，在葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎模型中發(fā)揮腸道保護作用[23]。本研究分子對接結果顯示木犀草素、芹菜素與疾病靶點存在穩(wěn)定結合位點，提示白術有效化合物可通過靶向作用于多個疾病相關靶點發(fā)揮藥理作用。

圖5 部分化合物與靶標蛋白對接分子圖Fig.5 Molecular diagram of docking of some compounds with target protein

PPI網絡結果顯示白術有效成分可能通過AKT1、IL-10、IL-6、MMP-9、PTGS1等藥物-疾病共有靶點網絡發(fā)揮作用。AKT1參與多條信號通路，具有廣泛生理作用，能夠通過磷脂酰肌醇-3-激酶-蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol-3-kinase-threonine protein kinase，PI3K-AKT）信號通路調節(jié)腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展[24]。除此之外，核心蛋白網絡拓撲分析結果顯示，PI3KAKT信號通路還參與調控多種免疫調節(jié)蛋白及炎癥因子的表達，如IL-10、PTGS1、ICAM-1等，而UC的發(fā)病恰好與免疫失調及炎癥反應相關，因此本研究結果再次說明白術通過多分子、多靶點、多途徑發(fā)揮治療UC的作用。

GO生物進程富集分析提示，相關生物進程包括基因沉默調控、端粒組織、DNA復制依賴性核小體組裝等。KEGG通路分析結果顯示，核心靶點主要富集于Wnt信號通路、PI3K-AKT信號通路等多種炎癥相關通路。其中EP300相互作用分化抑制因子1（EP300-interacting inhibitor of differentiation 1，EID1）、 環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREBBP）、p53蛋白、 卡林-1（cullin-1，CUL1）等核心靶點主要富集于Wnt信號通路上，Wnt信號通路主要參與細胞生物體軸分化過程、基因轉錄的調節(jié)[25]。Trinath等[26]研究發(fā)現，巨噬細胞膜上的toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）dectin-1的激活情況決定了巨噬細胞自身的活性，dectin-1通過介導Wnt/β-catenin通路激活，將抑制由TLRs激活的巨噬細胞促炎活性，減少IL-12、IL-1β、TNF-α的表達?？寡鬃饔门cWnt信號通路密切相關，相關研究報道，Wnt配體在腸道中表達，β-catenin信號在小腸和大腸的樹突狀細胞（dendritic cell，DC）中激活，促進DC向DCreg方向分化，從而介導免疫耐受[27]。Wnt信號通路還可以調節(jié)CD4+T細胞向Treg分化，抑制向Th17方向分化，改善由于Th17/Treg比例失衡導致的炎癥反應的失衡[28]。這與本研究所預測的結果一致，再次說明白術通過對生物途徑、多信號通路起到治療UC的作用。

本研究基于網絡藥理學和分子對接技術，分析了白術治療UC的潛在分子生物學機制，結果表明，白術通過多成分、多靶點、多途徑起到治療作用，但網絡藥理學只是基于現有大數據對白術治療UC的內在作用機制做出合理預測，存在一定的滯后性，而且未進一步進行實驗驗證。本課題組后續(xù)將基于此預測分析結果，對篩選所得的靶點、通路進行細胞及動物水平驗證，進一步明確白術通過免疫調節(jié)、抗炎等信號通路治療UC的內在作用機制，為白術治療UC的基礎和臨床研究提供更多科學依據。