鮑天宇，王衛(wèi)強(qiáng)，羅 超，賈宇童，李 闊

（遼寧石油化工大學(xué)石油天然氣工程學(xué)院，遼寧撫順113001）

我國的含蠟原油儲量非常豐富，據(jù)統(tǒng)計90% 原油蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%~40%[1]。含蠟原油在運(yùn)輸過程中，當(dāng)溫度降低至原油析蠟點時，原油中的蠟晶結(jié)晶析出,進(jìn)而以管壁粗糙凸起處為結(jié)晶中心聚集，形成蠟沉積[2?3]。輸油管道結(jié)蠟后導(dǎo)致含蠟原油的黏度增加，管道流通面積減小，流動阻力增加，致使含蠟原油輸送效率降低[4]。甚至當(dāng)管壁結(jié)蠟達(dá)到一定程度時會堵塞管路，直接影響含蠟原油生產(chǎn)，造成間接經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前國內(nèi)常用的含蠟原油輸送方式有加熱輸送、稀釋輸送、添加化學(xué)藥劑輸送等[6]，但這些方法均有自身不可克服的缺陷。

微生物清防蠟技術(shù)通過微生物自身活動來降解含蠟原油中大分子結(jié)構(gòu)烴類（長碳鏈烴），從而打破含蠟原油中大分子聚合結(jié)構(gòu)（降解為短碳鏈烴），減少重質(zhì)組分，降低含蠟量[7]。利用微生物法對含蠟原油進(jìn)行有效的除蠟降黏，可改善含蠟原油流動性，最終保證含蠟原油的正常生產(chǎn)，管線正常輸送，大幅降低管輸費(fèi)用[8]。

針對大慶含蠟原油特點，從被大慶原油污染的土壤中挑選出一株解烴菌，對其除代謝產(chǎn)物性能及除蠟降黏效果進(jìn)行研究。

1 實驗部分

1.1 培養(yǎng)基成分

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉10 g/L，純水1 000 mL，pH 7.0。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：純水1 000 mL，NaCl 5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，KH2PO45 g/L，K2HPO45 g/L，NaNO32 g/L，液 體 石 蠟2 mL，pH 7.0~7.2。

1.2 實驗油樣

實驗油樣來自于大慶油田，蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%，在37 ℃條件下表觀黏度為2 862 mPa·s。

1.3 實驗儀器

恒溫水浴振蕩器（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；生化恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；紫外分光光度計（上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司）；pH 計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；離心機(jī)（日本HITACHI）；JJ2000B 型旋轉(zhuǎn)滴界面張力測量儀（上海中晨數(shù)字設(shè)備有限公司）；Q2000 DSC 差示熱量掃描儀（美國TA 梅特勒?利托多公司）；HAKEE 流變儀（上海珩璟科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株篩選 將5 g 大慶油田油污土壤加入100 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，放入恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)至溶液渾濁（振蕩條件為37 ℃、150 r/min），取1 mL 培養(yǎng)基上清液轉(zhuǎn)接到新鮮100 mL 的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在同等條件下培養(yǎng)至溶液渾濁，如此反復(fù)轉(zhuǎn)接5 次，得到解烴菌菌液，然后取100 μL 菌液均勻涂布到LB 固體培養(yǎng)基上，放入生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再用接種環(huán)挑取單菌在新鮮LB 固體培養(yǎng)基上劃線純化，最終得到純化后的解烴菌。

1.4.2 解烴菌生長環(huán)境優(yōu)化 對該菌在不同溫度、pH、轉(zhuǎn)速條件下優(yōu)化其生長環(huán)境。

光密度值測定：將純化后的解烴菌菌液以5%接種量(體積分?jǐn)?shù)，下同）接到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別在30、32、34、36、38 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，通過紫外分光光度計在波長為600 nm 處測定菌液光密度值。

pH 測定：利用pH 計將培養(yǎng)基pH 調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，菌液光密度值測定方法同上。

轉(zhuǎn)速測定：將搖床轉(zhuǎn)速分別調(diào)至90、120、150、180、210 r/min，菌液光密度值測定方法同上。

1.4.3 解烴菌代謝產(chǎn)物性能分析 將菌株以5%接種量種于100 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并增設(shè)不加菌為對照，在37 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)7 d。

乳化性能分析：采用離心機(jī)離心去除菌體[9]，得到無菌上清液，取4 mL 無菌上清液與4 mL 液體石蠟混合后,通過渦旋振蕩器振蕩2 min，在室溫條件下放置24 h 后測定乳化層高度，乳化高度值與總高度值之比即為乳化指數(shù)。

界面張力測定：采用離心機(jī)離心去除菌體，得到上清液，通過界面張力儀測定液體表面張力[10]。

排油活性測定：采用離心機(jī)離心去除菌體，得到無菌上清液，取60 mL 無菌水倒入直徑為15 cm的無菌潔凈平板中，并在表面滴1 mL 液體石蠟形成油膜，滴一滴無菌上清液，觀察排油現(xiàn)象，并測量排油圈直徑大小。

1.4.4 解烴菌除蠟性能分析 將菌株以5% 接菌量接入100 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并加入40 mL 大慶含蠟原油（蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%，密度為873 kg/m3，37 ℃表觀黏度為2 862 mPa·s），在37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d 后，利用Q2000 DSC 差示熱量掃描儀測定經(jīng)解烴菌菌液處理前后的大慶油田油樣中蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在測量前，使用電子天平準(zhǔn)確稱取4 ~6 mg 油樣放入坩堝中，將坩堝蓋蓋好壓緊放入儀器中，通過差示掃描量熱儀測定含蠟原油蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)、析蠟點、析蠟高峰點等參數(shù)變化，得到DSC曲線，放熱峰的內(nèi)插基線與DSC 曲線包圍的峰面積即蠟晶放熱量，采用式（1）對原油蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行計算[11]。

式中，TC為熱譜線偏離基線對應(yīng)的溫度，℃；dQ 為蠟釋放出的熱量，J/g；-Q 為蠟的平均結(jié)晶釋放熱，J/g。

1.4.5 解烴菌降黏性能分析 將菌株以5% 接菌量接入100 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并加入40 mL 大慶含蠟原油（蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%，密度為873 kg/m3），在37 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)7 d 后低速離心脫水，通過流變儀測量經(jīng)解烴菌作用前后含蠟原油黏度變化[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長環(huán)境優(yōu)化

通過紫外分光光度計測得該解烴菌在不同溫度下的生長曲線如圖1 所示。由圖1 可見，解烴菌的活性強(qiáng)度隨溫度變化呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，當(dāng)溫度較低時，解烴菌細(xì)胞內(nèi)酶的活性隨之下降，使物質(zhì)代謝過程中各種生化反應(yīng)速度減慢，因而解烴菌的繁殖速度也隨之減慢；相反，當(dāng)溫度過高時，解烴菌的生長也遭到抑制。所以，確定較佳生長溫度為36 ℃。

圖1 不同溫度下解烴菌生長曲線Fig.1 Growth curve of hydrocarbon?solving bacteria at different temperatures

紫外分光光度計測得該解烴菌在不同pH 條件下的生長曲線如圖2 所示。由圖2 可見，解烴菌在pH 6.0~8.0 的活性都是先增高后降低。隨著pH 的升高，解烴菌生長受阻，當(dāng)超過最適pH 時，引起解烴菌的死亡。確定pH 為7.0 時，解烴菌表現(xiàn)出良好的生長特性。

圖2 不同pH 下解烴菌生長曲線Fig. 2 Growth curve of hydrocarbon?solving bacteria at different pH values

紫外分光光度計測得該解烴菌在不同搖床轉(zhuǎn)速（90~210 r/min）條件下的生長曲線如圖3 所示。由圖3 可以看出，搖床的轉(zhuǎn)速太高和太低都不適宜解烴菌生長，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min 時，解烴菌生長量不高；當(dāng)轉(zhuǎn)速為210 r/min 時，解烴菌生長速度慢，確定解烴菌最佳的搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.2 代謝產(chǎn)物性能分析

排油活性測定：通過觀察細(xì)菌代謝產(chǎn)物形成的排油圈(見圖4)可以看出，在水面上形成的油膜在表面活性物質(zhì)作用下從油膜中心向四周排擠，在中心形成一塊清潔圓形區(qū)域，測得其直徑為7.7 cm。中心圓形區(qū)域的大小與代謝產(chǎn)物的表面活性有關(guān)，中心區(qū)域圓形直徑越大，活性強(qiáng)度越高，這表明該菌代謝產(chǎn)物表面活性強(qiáng)，有利于細(xì)菌降解。

圖3 不同搖床轉(zhuǎn)速下解烴菌生長曲線Fig. 3 Growth curve of hydrocarbon?decomposing bacteria at different rotating speeds

圖4 發(fā)酵液排油活性檢測Fig. 4 Detection diagram of oil removal activity of fermentation broth

乳化指數(shù)測定：乳化指數(shù)是微生物清防蠟的一個重要指標(biāo)[13]。微生物在以石蠟為碳源進(jìn)行新陳代謝時，會產(chǎn)生一些表面活性劑，這類表面活性劑與石蠟混合后會產(chǎn)生乳化作用，乳化作用會增加石蠟在液相中與烴類物質(zhì)的接觸表面積，從而提高細(xì)菌對石蠟的降解[14?15]。測得本實驗乳化層高度為5.7 cm，乳化指數(shù)為71%，而對照組未產(chǎn)生乳化，說明該解烴菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的乳化性能，可促進(jìn)細(xì)菌對石蠟的降解。

界面張力測定：采用離心機(jī)離心去除菌體，得到無菌上清液，通過界面張力儀測定液體表面張力變化[16]。測得對照組界面張力為78.34 N/m，實驗組的界面張力為39.49 N/m，表明該菌株代謝產(chǎn)物具有降低界面張力的作用，界面張力的降低有利于石蠟在液相中的溶解度，界面張力越低，石蠟在液相中越易溶解，細(xì)菌能更好吸收利用，可促進(jìn)細(xì)菌對石蠟的降解。

2.3 解烴菌除蠟性能分析

利用Q2000 DSC 差示熱量掃描儀對經(jīng)解烴菌菌液處理前后大慶油田油樣蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)、析蠟點和析蠟高峰點進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 解烴菌處理前后大慶含蠟原油差示熱量掃描Fig. 5 Differential heat scanning of waxy crude oil in Daqing before and after treatment with hydrocarbon bacteria

從圖5 可以看出，大慶含蠟原油未經(jīng)菌株處理的結(jié)晶放熱值為36.79 J/g，蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%，析蠟點為46.93 ℃，析蠟高峰點為22.80 ℃；而經(jīng)菌株處理后，結(jié)晶放熱值為16.70 J/g，原油蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.0%，析蠟點為44.80 ℃，析蠟高峰點為21.93 ℃。從以上結(jié)果分析得到，含蠟原油在經(jīng)菌株作用7 d 后，原油蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)、析蠟點以及析蠟高峰點均產(chǎn)生了顯著變化。原油蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低可降低含蠟原油輸送管道的結(jié)蠟程度，而析蠟點以及析蠟高峰點的降低表明該菌株在一定程度上可起到防蠟的作用[17?18]。

2.4 解烴菌降黏性能分析

含蠟原油經(jīng)菌株在最優(yōu)環(huán)境下作用7 d 后，通過流變儀測得原油黏度變化如圖6 所示。從圖6 中可以看出，含蠟原油經(jīng)菌株處理后，非牛頓流體黏度下降較為顯著，反常點由53 ℃降為50 ℃。這表明該菌株通過除蠟降低了原油黏度，改善了流動性，可大幅降低含蠟原油管輸費(fèi)用[19]。

圖6 解烴菌處理前后原油黏溫曲線Fig. 6 Crude oil viscosity?temperature curve before and after treatment by hydrocarbon?decomposing bacteria

3 結(jié) 論

（1）在室內(nèi)條件下，從被大慶原油污染的土壤中篩選出一株解烴菌。該菌種在36 ℃、pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min 的培養(yǎng)環(huán)境下，生長狀況較好。

（2）經(jīng)實驗測得，該解烴菌代謝產(chǎn)物性能乳化指數(shù)為71%，具有較強(qiáng)的表面活性和排油活性，可使液體表面張力從78.34 N/m 降低到39.49 N/m，在一定程度上增強(qiáng)蠟的溶解。

（3）含蠟原油經(jīng)解烴菌處理后，蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低54%，析蠟點降低2 ℃，反常點降低3 ℃，黏度降低15%，有效改善了大慶原油的流動性，適用于一定條件下含蠟原油的開采及輸送，為輸油管道清防蠟提供了另一種方法。