蓋盼盼 孔新珂 趙仕凡 李峰

摘?要?基于生物燃料電池的自供能生物傳感器，目標(biāo)物濃度直接與生物燃料電池的輸出信號(hào)成比例關(guān)系，因此，自供能生物傳感平臺(tái)具有無需額外電源、裝置簡單、利于微型化、抗干擾能力強(qiáng)等突出優(yōu)勢。但是，生物燃料電池中常用的生物催化劑易失活，導(dǎo)致自供能生物傳感器性能不佳。本研究采用分子印跡多孔金陽極為生物陽極，實(shí)現(xiàn)對葡萄糖的選擇性催化，以Fe（CN）63/聚咪唑鎓鹽（Pim）/還原氧化石墨烯復(fù)合物Fe（CN）63/Pim/rGO為生物陰極，構(gòu)建生物燃料電池，集成陰離子交換策略與分子印跡技術(shù)，發(fā)展了一種基于生物燃料電池的自供能生物傳感方法，實(shí)現(xiàn)了肝素（Hep）的超靈敏檢測。當(dāng)無目標(biāo)分子Hep存在時(shí)，基于生物燃料電池的自供能生物傳感器可獲得較高的開路電壓與輸出功率;加入Hep后，由于聚合物Pim對Hep的親和性遠(yuǎn)大于Fe（CN）63，導(dǎo)致Fe（CN）63從復(fù)合物Fe（CN）63/Pim/rGO中釋放，致使生物陰極得電子活性物質(zhì)減少，陰極還原信號(hào)明顯減弱，此時(shí)，開路電壓和功率輸出顯著降低?；诖耍赏ㄟ^檢測生物燃料電池輸出性能的變化實(shí)現(xiàn)Hep的超靈敏檢測，檢出限低至0.01 pmol/L，低于目前文獻(xiàn)中報(bào)道的檢測方法。

關(guān)鍵詞?生物燃料電池; 分子印跡多孔金; 陰離子交換原理; 肝素; 鐵氰化鉀/聚咪唑鎓鹽/還原氧化石墨烯復(fù)合物; 自供能生物傳感器

1?引 言

基于生物燃料電池（Biofuel cell，BFC）的自供能生物傳感器，目標(biāo)物濃度直接與生物燃料電池的輸出信號(hào)成比例關(guān)系，因此，自供能生物傳感平臺(tái)具有無需額外電源、裝置簡單、利于微型化、抗干擾能力強(qiáng)等獨(dú)特優(yōu)勢，在臨床診斷、食品分析、環(huán)境檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1，2]。Dong等[3，4]基于酶活性、位阻效應(yīng)等實(shí)現(xiàn)了重金屬離子與生物酶的自供能檢測; 也有研究者將生物共軛體與生物燃料電池結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了糖基化產(chǎn)物與抗生素的超靈敏檢測[5，6]。上述自供能生物傳感平臺(tái)為生化分析及生物傳感提供了新技術(shù)。由于自供能生物傳感方法是基于BFC生物陰陽極設(shè)計(jì)，因此，電池輸出性能直接影響傳感器的靈敏度與穩(wěn)定性，尤其是生物來源的酶的穩(wěn)定性是自供能傳感器穩(wěn)定的前提，但天然酶極易失活[7]。研究發(fā)現(xiàn)，多種納米材料（如MnO2納米片、金納米粒子（AuNPs））等對葡萄糖具有良好的催化性能，與傳統(tǒng)生物酶相比，納米材料具有合成方法簡單、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)勢。因此，基于納米材料構(gòu)建生物燃料電池在穩(wěn)定性與成本方面更具優(yōu)勢[8]。例如，Lin等[9]的研究表明，修飾于介孔硅表面裸露的AuNPs表現(xiàn)出兩種類酶的性能（葡萄糖氧化酶和過氧化物酶），既能催化葡萄糖氧化，又能催化過氧化氫反應(yīng)。但是，AuNPs對葡萄糖的催化活性受pH值影響較大。相比之下，多孔納米金（NPG）具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，活性幾乎不受外界因素干擾，且穩(wěn)定性更高[10，11]。分子印跡聚合物（MIP）是通過分子印跡技術(shù)合成對特定目標(biāo)分子（模板分子）及其結(jié)構(gòu)類似物具有特異性識(shí)別和選擇性吸附的聚合物，其中的識(shí)別位點(diǎn)可通過氫鍵作用、靜電作用、共價(jià)作用等識(shí)別目標(biāo)分子[12]。為增強(qiáng)陽極材料對葡萄糖催化的選擇性，Li等[13]將分子印跡聚合在泡沫鎳表面，實(shí)現(xiàn)了對堿性環(huán)境中的葡萄糖選擇性檢測。本研究將MIP引入到多孔納米金中，特異性識(shí)別葡萄糖，并作為生物燃料電池的陽極。

將超分子識(shí)別與分析檢測機(jī)理結(jié)合，發(fā)展新型傳感分析方法，利于拓寬分析目標(biāo)物檢測范圍; 將超分子識(shí)別與熒光法結(jié)合，可識(shí)別并檢測各種陰離子物質(zhì)[14]; 將超分子識(shí)別與電化學(xué)方法結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)電化學(xué)惰性分子的安培檢測。其中，陰離子交換反應(yīng)是利用配位受體實(shí)現(xiàn)陰離子物質(zhì)的識(shí)別與傳感[15]。肝素（Hep）作為一種重要的惰性生物分子，在調(diào)控各種生理病理等過程中發(fā)揮了重要作用，如常見的凝血和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長、免疫防御、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等[16]。目前，檢測Hep的方法主要有熒光法[17～19]、比色法[20]等，但存在靈敏度較差、步驟繁瑣等缺點(diǎn)。電化學(xué)檢測法靈敏度高、成本低、效果好，但此類研究較少，且強(qiáng)負(fù)電性的電化學(xué)惰性Hep較難檢測。研究者利用正電性聚合物能與很多陰離子形成離子氫鍵（CH）+···X的屬性，實(shí)現(xiàn)了惰性分子Hep的檢測[21～23]。

本研究將陰離子交換策略和分子印跡技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建了基于生物燃料電池的自供能生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了肝素的超靈敏檢測。自供能生物傳感器由分子印跡納米多孔金（MIP/NPG）的生物陽極及Fe（CN）63/聚咪唑鎓鹽（Pim）/還原氧化石墨烯復(fù)合物（Fe（CN）63/Pim/rGO）生物陰極構(gòu)成。在本研究中，MIP/NPG在中性條件下能實(shí)現(xiàn)葡萄糖的有效氧化。MIP/NPG修飾的生物陽極構(gòu)建過程及肝素自供能檢測原理見圖1。首先，將納米多孔金修飾于ITO表面，然后通過電聚合的方式將MIP修飾于NPG上（圖1A），洗脫葡萄糖模板分子后，可實(shí)現(xiàn)對葡萄糖的選擇性檢測。對于生物陰極，將帶正電荷的Pim固定到rGO/ITO表面，帶負(fù)電荷的Fe（CN）63通過靜電作用吸附到Pim/rGO/ITO表面。對于組裝完成的自供能檢測體系（圖1B），當(dāng)無Hep存在時(shí)，陽極MIP/NPG催化葡萄糖氧化產(chǎn)生電子，經(jīng)外電路，陰極Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO得電子，產(chǎn)生較強(qiáng)的陰極還原電流與較高的開路電壓（EOCV）。當(dāng)Hep存在時(shí)，生物陰極發(fā)生陰離子交換反應(yīng)，Hep吸附到Pim上，導(dǎo)致Fe（CN）63從Pim/rGO/ITO陰極脫離，阻礙了Fe（CN）63的還原過程，導(dǎo)致生物燃料電池的最大功率輸出（Pmax）和EOCV都明顯降低，從而實(shí)現(xiàn)Hep的超靈敏檢測。將此自供能生物傳感器用于檢測實(shí)際血清樣本，結(jié)果令人滿意。本研究構(gòu)建的傳感平臺(tái)在生物體系代謝成分檢測方面具有較好的應(yīng)用前景。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

JSM-7500F掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）; HT7700 透射電子顯微鏡、CF15RX Ⅱ 離心機(jī)（日本日立公司）; Milli-Q 純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）; Autolab PGSTAT 302N電化學(xué)工作站（瑞士萬通公司）。

β-D-葡萄糖（日本東京化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社）; 丙烯酰胺、N，N′-亞甲基丙烯酰胺（MBA）、K2SO4、K2S2O8（國藥控股（上海）化學(xué)試劑有限公司）; 2，2-偶氮異丁腈（AIBN）、Hep、1-乙烯基咪唑和1-氯丁烷（美國Sigma 公司）; 氧化石墨烯（GO，南京先豐納米材料科技有限公司）。支持電解質(zhì)為Na2HPO4和NaH2PO4配制的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PB，pH 7.4）。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)前無需純化或處理。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率>18.2 MΩ cm）。

2.2?MIP/NPG生物陽極的制備

按照文獻(xiàn)[24]的方法合成NPG，取50 μL NPG滴涂在ITO表面（電極面積為0.5 cm × 0.5 cm），37℃干燥2 h。隨后，通過自由基聚合法制備MIP，具體步驟為：將100 μL 0.1 mmol/L葡萄糖，加入含42 μmol/L丙烯酰胺、0.4 mol/L K2SO4、10 mmol/L K2S2O8和8.0 mmol/L交聯(lián)劑MBA的5 mL水溶液，充氮?dú)? h后，以NPG/ITO電極為工作電極，采用循環(huán)伏安法（CV，電壓范圍為0.80～1.00 V，掃描速率為100 mV/s）進(jìn)行電聚合，在甲醇-乙酸（9∶1，V/V）溶液中洗脫20 min，除去葡萄糖模板分子，將電極置于PB（pH 7.4）中浸泡2 min，即制得MIP/NPG/ITO電極，室溫干燥，備用。

2.3?Pim/rGO/ITO電極的制備

通過自由基聚合法制備得到Pim[21]，具體步驟為：將[Vbim][Cl]（3.0 g）、AIBN（0.015 g）、氯仿（30 mL）加入到三口燒瓶中，氮?dú)夥諊拢?0℃油浴中混合攪拌反應(yīng)18 h，冷卻到室溫，隨后加入乙醚，形成沉淀，在45℃進(jìn)行旋蒸，獲得的產(chǎn)物在50℃下真空干燥過夜，于4℃保存，備用。依照文獻(xiàn)[25]的方法采用電化學(xué)方法制備rGO，取60 μL GO溶液（0.38 mg/mL）涂敷在ITO表面（電極面積為0.5 cm × 0.5 cm），37℃干燥1.5 h，采用電化學(xué)還原法制得rGO，電壓范圍為1.5～0.5 V，聚合速率為100 mV/s，電解質(zhì)溶液為0.10 mol/L PB（pH 7.4）。最后，取60 μL制備的Pim溶液滴涂在上述制得的rGO/ITO電極表面，37℃干燥后，制得Pim/rGO/ITO電極。

2.4?Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極的構(gòu)建

將制得的Pim/rGO/ITO電極置于含1 mmol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L PB緩沖溶液中進(jìn)行CV電聚合，電壓范圍為0.2～0.6 V，掃描速率為50 mV/s。 將電極取出，在0.10 mol/L PB溶液中，按照上述CV參數(shù)繼續(xù)掃描，直至獲得穩(wěn)定的氧化還原峰，即得到Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極，干燥后備用。

2.5?Hep的自供能生物傳感檢測

基于MIP/NPG生物陽極與Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極，構(gòu)建基于生物燃料電池的自供能傳感平臺(tái)。電解質(zhì)為含5 mmol/L葡萄糖的0.10 mol/L PB（pH 7.4）。首先，測定BFC的最大EOCV和Pmax。隨后，將Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極浸泡在Hep溶液中，孵育一定時(shí)間后，取出電極，用水沖洗，測量BFC的開路電壓和輸出功率。

3?結(jié)果與討論

3.1?陽極材料形貌及催化性能表征

NPG形貌對葡萄糖催化性能有很大影響。采用掃描電子顯微鏡（SEM）對NPG與MIP/NPG的形貌進(jìn)行表征。NPG具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2A），去除模板后的MIP/NPG形貌均一（圖2B）。MIP具有較多活性位點(diǎn)和均一的孔結(jié)構(gòu)，有利于識(shí)別并催化葡萄糖分子。

MIP的存在提高了NPG對燃料葡萄糖的選擇性，相比于NPG，MIP/NPG是一種更理想的催化劑。本研究考察了MIP/NPG在中性環(huán)境下對葡萄糖的催化效果。如圖3所示，葡萄糖氧化的初始電位值為0.3 V，隨著葡萄糖濃度遞增，催化電流也逐漸增加。

當(dāng)葡萄糖濃度為0.6 mmol/L、電壓為0.4 V時(shí)，催化電流達(dá)到110 mA，表明陽極材料MIP/NPG對葡萄糖具有優(yōu)異的催化氧化性能。與之前報(bào)道的多孔金納米粒子的催化性能相比[24]，催化電流明顯增大。

3.2?生物陰極材料形貌表征

生物陰極Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO的設(shè)計(jì)是自供能生物傳感檢測Hep的關(guān)鍵。還原氧化石墨烯（rGO）具有優(yōu)異的導(dǎo)電性、大的比較面積，不僅可用于固定大量聚合物Pim，還可增強(qiáng)電極的導(dǎo)電性[25]。采用透射電子掃描顯微鏡（TEM）與SEM對氧化石墨烯（GO）、rGO的形貌進(jìn)行了表征（圖4A和4C），GO與rGO均為均勻的薄膜狀態(tài)，分散性好。在TEM圖中，合成的Pim呈片狀結(jié)構(gòu)（圖4B），表明成功合成受體Pim。同時(shí)，對Pim/rGO的形貌進(jìn)行了SEM表征（圖4D），Pim/rGO呈現(xiàn)較好的均勻連續(xù)的褶皺結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)利于Fe（CN）63吸附。

3.3?陰極催化性能表征

采用CVs測試了陰極的電化學(xué)性能。如圖5A所示，相比于裸ITO電極，Pim/rGO/ITO電極充電電流明顯增加，表明rGO和Pim具有更大的比表面積。

相比之下，F(xiàn)e（CN）63/Pim/rGO/ITO電極有一對明顯的氧化還原峰，歸因于吸附到電極上的Fe（CN）63在電極表面良好的電子轉(zhuǎn)移過程。采用微分脈沖伏安法（DPV）對不同濃度的Hep進(jìn)行檢測。在含有不同濃度Hep的0.1 mol/L PB緩沖溶液（pH 7.4）中，隨著Hep濃度增大，F(xiàn)e（CN）63/Pim/rGO/ITO電極電流逐漸降低，表明Fe（CN）63在電極表面上的還原反應(yīng)逐漸減弱。這說明加入Hep，置換了吸附在Pim膜表面的Fe（CN）63，F(xiàn)e（CN）63濃度降低，生物陰極還原性能明顯減弱。

考察了Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO電極在Hep溶液中的浸泡時(shí)間對生物陰極還原電流的影響，如圖6所示，當(dāng)Hep濃度為20 pmol/L時(shí)，隨浸泡時(shí)間延長，電流降低，浸泡時(shí)間為0.6 min時(shí)，即可以觀察到電流信號(hào)的明顯變化，表明Hep與K3Fe（CN）6之間陰離子交換反應(yīng)速度較快。因此，陰離子交換誘導(dǎo)生物陰極還原電流變化為Hep的定量分析奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)證實(shí)了自供能生物傳感檢測Hep的可行性。

3.4?BFC性能表征

以Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO為生物陰極，MIP/NPG/ITO為生物陽極，構(gòu)建了無隔膜BFC。在常溫常壓條件下，BFC在含5 mmol/L葡萄糖的PB緩沖液（pH 7.4）中穩(wěn)定運(yùn)行。如圖7A所示，BFC最高EOCV可達(dá)0.78 V，最大電流密度為0.35 mA/cm2，Pmax達(dá)到120 μW/cm2，BFC的功率輸出在20天內(nèi)幾乎保持不變（圖7B），表明所構(gòu)建的BFC具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，為構(gòu)建性能優(yōu)異的自供能生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。

3.5?基于BFC的自供能生物傳感器對Hep的檢測

基于所構(gòu)建的生物燃料電池，發(fā)展了自供能生物傳感檢測平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了Hep的檢測。隨著Hep濃度增大，負(fù)電性更強(qiáng)的Hep置換Fe（CN）63，使其從Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極上脫離，導(dǎo)致生物陰極得電子物質(zhì)減少，信號(hào)減弱，從而影響B(tài)FC功率，輸出Pmax隨之降低（圖8A）。當(dāng)Hep濃度在0.1～100 pmol/L之間時(shí)，Pmax與Hep濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系（圖8B），線性方程為Pmax=52.12-13.87lgCHep（R2=0.9953），檢出限（LOD）為0.01 pmol/L（S/N=3），完全滿足術(shù)后與長期護(hù)理中臨床相關(guān)監(jiān)測的要求（1.7～10 μmol/L）[26]。與目前報(bào)道的檢測Hep的方法相比（表1），本方法具有較低的檢出限與較寬的線性范圍。

3.6?實(shí)際樣品分析

將此自供能生物傳感器用于實(shí)際血清樣品中Hep的檢測。如表2所示，3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率在925%～102.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）低于3.2%，表明此傳感器具有較好的重現(xiàn)性。更重要的是，此自供能生物傳感器對Hep的檢出限低至0.01 pmol/L，有望應(yīng)用于臨床診斷中Hep的生物測定。

4?結(jié) 論

將陰離子交換策略與分子印跡技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建了基于生物燃料電池的自供能生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了Hep的高靈敏檢測。Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極中，Pim與Hep之間具有強(qiáng)的親和力，置換出生物陰極中Fe（CN）63，使其脫離電極，生物陰極活性降低，導(dǎo)致BFC輸出功率降低。根據(jù)Pmax信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對Hep的高靈敏檢測，檢出限低至0.01 pmol/L，優(yōu)于目前報(bào)道的檢測方法。此外，此裝置不需要外部電源供電，傳感設(shè)備簡單、易于攜帶，便于現(xiàn)場實(shí)時(shí)監(jiān)測。本研究所構(gòu)建的超靈敏、簡易的自供能生物傳感系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)和生物體系的現(xiàn)場實(shí)時(shí)監(jiān)測中具有良好的應(yīng)用前景。

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