文楊，張軍，王毅

作者單位：重慶市高新區(qū)人民醫(yī)院，a急診重癥醫(yī)學(xué)科，b呼吸科，重慶400039

肺炎是一種常見的疾病，在一部分病人中變得嚴(yán)重，這取決于宿主的免疫抵抗［1］。2016 年的死亡率趨勢(shì)分析顯示，美國肺炎繼續(xù)造成的死亡人數(shù)超過任何其他傳染病，在之前的34年期間沒有任何改善［2］。即使不是致命的，肺炎也可能是嚴(yán)重的；1/5的肺炎住院病人需要進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)病房，其中1/3需要機(jī)械通氣［3］。重癥肺炎病程急，易引起多器官衰竭，病死率高。在臨床上中藥治療重癥肺炎取得良好的效果，如清燥救肺湯、清金化痰湯、通腑清熱化痰中藥等［4-6］。大量研究報(bào)道，麻杏石甘湯（MGD）在重癥肺炎的治療中具有良好的治療效果，但是，其機(jī)制尚未清晰。本研究于2018年5月至2019年1月通過肺炎克雷伯菌建立重癥肺炎大鼠模型，檢測(cè)MGD對(duì)大鼠血清中炎性因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）含量的影響，揭示MGD的抗炎功能與抑制NF-κB信號(hào)通路相關(guān)，為MGD治療重癥肺炎提供參考。

1 材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無特定病原體（SPF）級(jí)大鼠（230～250 g）80 只，購于湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)生物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)章程對(duì)動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)；肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株購于ATCC；加味MGD 顆粒（麻黃4 g、苦杏仁10 g、生石膏20 g、甘草4 g、防風(fēng)10 g、前胡10 g、黃芩10 g）由北京康仁堂藥業(yè)公司贈(zèng)送；兔抗鼠核因子κB 抑制蛋白（IκBα）多克隆抗體、兔抗鼠p65 多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化IκBα（p-IκBα）多克隆抗體購于美國Cayman Chemical；羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G（IgG）抗體購于上海烜雅生物科技有限公司；大鼠TNF-α 檢測(cè)試劑盒、大鼠 IL-6 檢測(cè)試劑盒、大鼠 IL-1β 檢測(cè)試劑盒均購于碧云天；聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）購于德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、ECL 發(fā)光液和RIPA 蛋白裂解液均購于大連Takara公司。

1.2方法

1.2.1 重癥肺炎大鼠模型的制造 將大鼠手術(shù)前24 h禁食，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。將大鼠固定后，切開頸部皮膚，暴露上段氣管，再用1 mL注射器穿刺滴入0.30 mL 的肺炎克雷伯菌液，迅速樹立固定大鼠，使菌液均勻于肺部，最后，縫合傷口并消毒。接種后正常培養(yǎng)大鼠，至第6 天成功建立重癥大鼠肺炎模型，標(biāo)記為模型組。

1.2.2 分組與處理 MGD 制備：按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》煎制麻黃、杏仁、甘草、石膏。先將麻黃、杏仁、甘草、石膏用雙蒸水浸泡1 h，然后將石膏煮20 min 后將浸泡的藥材一起煎煮20 min。取第一道汁加入2 倍雙蒸水煎煮15 min 后，取出汁液，混入第一道汁，將汁濃縮至原來的體積，調(diào)整濃度至23.65 g/kg。置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

分組：按照隨機(jī)數(shù)字表法將正常飼養(yǎng)的80只大鼠分成對(duì)照組、模型組、模型+0.9%氯化鈉溶液組、模型+MGD 組，每組20 只。對(duì)照組：正常飼養(yǎng)的20只大鼠；模型組：照1.2.1的方法將剩余60只大鼠進(jìn)行重癥肺炎模型制造；模型+0.9%氯化鈉溶液組：將20 只模型組大鼠進(jìn)行等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃；模型+MGD 組：將 20 只模型組大鼠進(jìn)行 MGD 灌胃。飼養(yǎng)15 d后進(jìn)行大鼠眼眶靜脈采血，之后進(jìn)行斷頸法處死大鼠，再無菌小心剝離完整的左肺部和右肺部，將血液和肺置于-20 ℃保存。

1.2.3 血?dú)庵笜?biāo)的分析 建模結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采取2 mL血液，對(duì)血?dú)庵笜?biāo)動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）、動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）和血氧飽和度（SaO2）進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.2.4 肺濕干比重的檢測(cè) 用電子天平稱量濕肺的重量，然后置于80 ℃烘箱中烘干20 h，再次稱量肺的重量，計(jì)算濕重/干重的比。

1.2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肺組織病理變化 取適量肺組織在多聚甲醛溶液中固定30 min，置于脫水機(jī)中脫水，經(jīng)透明浸蠟過夜后，進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟塊切片（厚4 μm），烤片機(jī)烘烤15 min，脫蠟、蘇木精染色10 min后，放入鹽酸乙醇中3 s，再置于氨水中5 s，最后放入伊紅中染色2 min，經(jīng)二甲苯透明、中性樹脂封片后，顯微鏡觀察。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量 按TNF-α 檢測(cè)試劑盒、IL-6檢測(cè)試劑盒、IL-1β檢測(cè)試劑盒說明書要求檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺組織中IκBα、p65、p-IκBα的蛋白表達(dá) 將大鼠的右肺用無菌剪碎，再在研缽中充分研磨，用RIPA 蛋白裂解液對(duì)研磨組織進(jìn)行冰上蛋白裂解30 min，提取總蛋白，以BCA法測(cè)定樣品蛋白的濃度。以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液（×5），混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，取60 μg 目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳。Quantity One 4.62圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析，Image J分析目的條帶的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用xˉ±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGD對(duì)肺炎大鼠肺組織病理組織觀察及血?dú)庵笜?biāo)的影響結(jié)果如圖1、表1所示，與對(duì)照組相比，模型組肺組織毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血出血、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞呈圍管狀浸潤(rùn)，PaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，SaO2顯著降低（P＜0.01）；與模型+0.9%氯化鈉溶液組相比，模型+MGD 組肺組織有少量或無炎癥細(xì)胞，PaO2顯著升高，PaCO2顯著降低，SaO2顯著升高（P＜0.001）。

表1 麻杏石甘湯（MGD）對(duì)重癥肺炎大鼠血?dú)庵笜?biāo)的影響/xˉ±s

2.2 MGD對(duì)肺炎大鼠肺組織濕干比重的影響四組濕干比整體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝14.686，P＜0.001）。與對(duì)照組相比，模型組濕干比顯著升高［（5.31±0.51）%比（3.98±0.33）%，P＜0.05］；與模型+0.9%氯化鈉溶液組相比，模型+MGD 組濕干比顯著降低［（4.29±0.40）%比（5.28±0.48）%，P＜0.05］。

2.3 MGD對(duì)肺炎大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響結(jié)果如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量均顯著升高（P＜0.001）；與模型+0.9%氯化鈉溶液組相比，模型+MGD組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量顯著降低（P＜0.001）。

表2 麻杏石甘湯（MGD）對(duì)重癥肺炎大鼠血清中炎性因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的影響/xˉ± s

2.4 MGD對(duì)肺炎大鼠肺組織中NF-κB信號(hào)通路活性的影響結(jié)果如圖2、表3所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中IκBα的蛋白表達(dá)量顯著降低，p65、p-IκBα 的蛋白表達(dá)量均顯著升高；與模型+0.9%氯化鈉溶液組相比，模型+MGD 組大鼠肺組織中IκBα的蛋白表達(dá)量顯著升高，p65、p-IκBα的蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。

圖2 麻杏石甘湯（MGD）對(duì)重癥肺炎大鼠肺組織中核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路表達(dá)的影響（蛋白質(zhì)印跡法）

表3 麻杏石甘湯（MGD）對(duì)重癥肺炎大鼠肺組織中核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路活性的影響/xˉ± s

3 討論

MGD是由麻黃、杏仁、石膏、甘草組成，源于《傷寒雜病論》，具有清肺平喘的功效［7］。程永華等［8］在重癥肺炎的病人中發(fā)現(xiàn)，MGD輔助西藥對(duì)重癥肺炎病人具有抑制炎性分泌、改善呼吸功能，緩解病情的功能，在臨床上具有較好的治療作用。張怡等［9］報(bào)道，加味MGD可抑制重癥肺炎病人血清中炎性因子的表達(dá)，并下調(diào)前白蛋白和高遷移率族蛋白B1的表達(dá)。姜麗等［10］報(bào)道，MGD的主要藥理成分在RSV肺炎大鼠中的吸收明顯優(yōu)于正常大鼠的吸收。本研究建立了肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)的重癥肺炎大鼠模型發(fā)現(xiàn)，MGD可抑制重癥肺炎大鼠血液中炎性因子的含量。

NF-κB是炎癥和免疫反應(yīng)的重要中介［11-13］，可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型的重要炎癥介質(zhì)，如TNF、IL-6、白細(xì)胞介素8（IL-8）、IL-1β、白細(xì)胞介素12（IL-12）和細(xì)胞色素C 氧化酶-Ⅱ（COX-Ⅱ）［14-16］。中藥安腸愈瘍湯可治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中炎性因子的含量，其功能與抑制NF-κB 的表達(dá)相關(guān)［17］；犀角地黃湯加味可通過抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活減輕敗血癥導(dǎo)致的小鼠肺部炎癥和損傷［18］；補(bǔ)肺湯可劑量依賴性調(diào)節(jié)Toll樣受體2（TLR2）/NF-κB信號(hào)通路改善慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重塑［19］；藤莓湯可通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體作用因子3（TRAF3）/NF-κB 信號(hào)通路改善膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜免疫炎性損傷［20］。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了重癥肺炎大鼠肺組織中NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白IκBα、p65、p-IκBα 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，該通路在重癥肺炎模型大鼠中的表達(dá)明顯升高，經(jīng)MGD 治療后，NF-κB 信號(hào)通路的活性明顯受到抑制，提示MGD在重癥肺炎大鼠中的治療功能的機(jī)制與失活NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。這些結(jié)果為探索MGD 的功能機(jī)制的研究提供了參考，也為MGD 治療重癥肺炎提供了更充分的理論依據(jù)。

（本文圖1見插圖9-3）

圖1 重癥肺炎大鼠肺組織病理圖片（HE染色×200）：A為對(duì)照組，B為模型組，C為模型+0.9%氯化鈉溶液組，D為模型+麻杏石甘湯（MGD）組