劉欣然 康家偉 王天星 郝云濤 珠娜 劉睿 胡佳妮 李臻 于曉晨 李勇

摘 要：目的：研究菠蘿蜜低聚肽（JOPs）干預對db/db糖尿病模型小鼠炎癥反應、血糖及血脂的影響作用。方法：選擇db/db糖尿病小鼠模型，將其隨機分為3個JOPs組（0.2、0.4、0.8g/kg·BW）以及糖尿病模型對照組、二甲雙胍對照組、乳清蛋白對照組，并選用db/m小鼠作為非糖尿病小鼠空白對照。經(jīng)過為期6個月的干預，檢測小鼠空腹血糖（FPG）、血清胰島素（INS）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素8（IL-8）、白細胞介素10（IL-10）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）、C反應蛋白（CRP）以及脂代謝指標。結果：JOPs可顯著降低db/db糖尿病小鼠空腹血糖水平及胰島素抵抗指數(shù);可使血清IL-6、TNF-α、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）顯著降低，并使高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）顯著升高。結論：JOPs干預可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，改善胰島素抵抗，同時有效調節(jié)炎癥反應及血脂代謝。

關鍵詞：菠蘿蜜低聚肽;降血糖;炎癥;db/db糖尿病小鼠

糖尿?。―M）是一種常見的內分泌代謝系統(tǒng)疾病[1-2]，常伴有長期免疫系統(tǒng)失衡、代謝綜合征或與肥胖相關的代謝異常，并且DM的許多并發(fā)癥也都表現(xiàn)出異常的炎癥反應，因此炎癥被認為是DM發(fā)生發(fā)展的主要驅動力并與胰島素抵抗（IR）密切相關。目前，防治DM及其并發(fā)癥已成為科學工作者研究的重點，其中控制血糖水平和調節(jié)炎癥反應則是重中之重。

生物活性肽（BAP）是從二肽到復雜的線性、環(huán)形結構的不同肽類的總稱，是源于蛋白質的多功能化合物，具有特殊的生理特性，在醫(yī)藥和保健食品領域的研究已成為熱點。研究發(fā)現(xiàn)，許多植物來源的BAP具有降血糖的功效，如燕麥低聚肽、人參低聚肽和核桃低聚肽等[3-7]。低聚肽作為BAP中的一類，因其更短小的氨基酸組成，具有更易吸收且活性更強的特性，有廣闊的發(fā)展前景。菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus ）主要產(chǎn)自東南亞、印度及我國南部。與其他熱帶水果相比，菠蘿蜜的果肉和種子均含有更多的蛋白質、鈣、鐵、維生素等，其中果肉中蛋白質含量為1.2%～1.9%，而通常不被利用的種子中則含有更多的蛋白質，含量為6.6%～7.0%，某些品種的菠蘿蜜種子蛋白質含量甚至高達11.85%[8-9] 。同時，菠蘿蜜中還有多種人體必需的氨基酸，如精氨酸、胱氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸等[10]，是水果中非常優(yōu)質的肽類來源。研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜具有一定的降血糖作用[11-12]，在短期菠蘿蜜低聚肽（JOPs）干預實驗中也可發(fā)現(xiàn)其顯著的降血糖作用，但對于其降糖機制以及對炎癥反應的影響尚不可知。同時，DM及炎癥發(fā)生的同時伴隨著的血脂代謝異常也值得關注。因此，本研究探究JOPs長期干預對于db/db糖尿病小鼠血糖及炎癥反應的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 受試物

JOPs，淡黃色固體粉末，利用生物酶解技術從菠蘿蜜果肉及種子中制取得到的小分子BAP的混合物，主要成分為分子量<1 000Da的低聚肽（海南盛美諾生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物

選擇12周齡SPF級雄性db/db型糖尿病小鼠（空腹血糖水平≥11.1mmol/L）48只及與之周齡、性別匹配的非DM健康同窩出生仔畜db/m小鼠（lepr-/m）8只。db/db小鼠及正常健康小鼠db/m均由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。動物飼養(yǎng)在北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，動物實驗環(huán)境設施（屏障環(huán)境）合格證書：醫(yī)動字第 01-2055。動物分籠飼養(yǎng)，每籠2只，均給予普通飼料，飼養(yǎng)環(huán)境符合屏障環(huán)境，溫度（25±1）℃，相對濕度50%～60%RH，室內照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。動物喂養(yǎng)及實驗操作嚴格按照《北京市實驗動物管理條例》執(zhí)行，并經(jīng)過北京大學醫(yī)學部倫理委員會審核通過（批準號：LA2017189）。

1.3 主要試劑和儀器

葡萄糖（純度99.8%），北京金匯太亞化學試劑有限公司;濃縮乳清蛋白Lacprodan 80，（純度79.2%），北京中柏創(chuàng)業(yè)化工產(chǎn)品有限公司;格華止鹽酸二甲雙胍片，國藥準字H20023370，中美上海施貴寶制藥有限公司;三諾安穩(wěn)血糖儀，長沙三諾生物傳感技術有限公司;胰島素ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所;IL-6 ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所;IL-8 ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所;IL-10 ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所;TNF-α ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所;BMG FLUO star Omega多功能酶標儀，BMG LABTECH公司;AU480全自動生化儀，日本奧林巴斯株式會社。

1.4 分組、劑量及干預方式

將48只db/db小鼠按空腹血糖水平隨機分為6組：1個模型對照組、1個陽性對照組（0.2g/kg·BW鹽酸二甲雙胍腸溶片水溶液）、1個乳清蛋白組（0.4g/kg· BW乳清蛋白水溶液）和3個JOPs劑量組（0.2、0.4、0.8g/kg·BW），每組8只。8只db/m小鼠作為空白對照組。各組干預方式均為每日經(jīng)口灌胃，持續(xù)6個月，實驗期間動物自由進食、飲水（表1）。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 一般情況 每日觀察各組大鼠狀態(tài)，定期記錄攝食和體重等情況。

1.5.2 空腹血糖及胰島素檢測 6個月干預結束后，將小鼠禁食5h，摘眼球取血后頸椎脫臼處死，將血液以3 000r/min離心10min分離血清，檢測FPG及INS濃度，并根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型法公式計算胰島素抵抗（HOMA-IR）指數(shù)，計算公式為式（1）：

HOMA-IR指數(shù)= FPG（mmol/L）×INS（mIU/L）/ 22.5（1）

1.5.3 炎癥因子檢測 收集血清方法同（2），按照試劑盒說明書操作測定IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α，采用全自動生化儀檢測C反應蛋白（CRP）。

1.5.4 血脂檢測 收集血清方法同（2），利用全自動生化儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 一般情況

干預期間，空白對照組小鼠（db/m）毛色黑亮有光澤，精神狀態(tài)良好。模型對照組皮毛松散，體表潮濕，精神狀態(tài)較差，活動量明顯少于空白對照組，而JOPs干預后的小鼠毛色及精神狀況逐漸有所好轉，活動量有所增加，干預時期內極少出現(xiàn)感染癥狀（如尿道感染等）。干預期間，各DM組（db/db）小鼠體重均高于空白對照組（db/m）小鼠，但DM小鼠各組間差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 JOPs對糖尿病小鼠空腹血糖及胰島素的影響

干預前，空白對照組小鼠FPG均值為7.09mmol/L，db/db 2型DM模型小鼠FPG值均大于11.1mmol/L，已達到2型DM的標準;并且在干預期間，模型對照組小鼠隨機FPG也并無明顯變化，說明該DM模型較為穩(wěn)定，符合后續(xù)研究的需要。于JOPs干預的第6個月為小鼠禁食并斷頭處死，收集檢測小鼠FPG、空腹INS濃度。db/db DM小鼠FPG均明顯高于正常組小鼠，而相比模型對照組小鼠，JOPs干預的3組小鼠FPG均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。JOPs干預后的小鼠INS水平較模型對照組無顯著差異（表2）。

根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型法公式計算各組小鼠HOMA-IR指數(shù)。由附圖可見，空白對照組小鼠HOMA-IR指數(shù)顯著低于其他各組，說明各組DM小鼠都處于嚴重的IR狀態(tài)。而相比模型對照組，JOPs-HG小鼠HOMA-IR指數(shù)顯著降低（P<0.05），說明JOPs干預可以改善IR;同時，JOPs-LG和JOPs-MG小鼠HOMA-IR指數(shù)也有一定程度的降低，但差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 JOPs對糖尿病小鼠炎癥因子的影響

如表3所示，空白對照組及JOPs-MG小鼠血清IL-6含量較模型對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;空白對照組及JOPs干預的3組小鼠血清TNF-α含量均顯著低于模型對照組（P<0.05）;對于血清CRP來說，僅有空白對照組內含量顯著低于模型對照組（P<0.05）;模型對照組小鼠的血清IL-8、IL-10含量與其他組相比差異無統(tǒng)計學差異。

2.4 JOPs對糖尿病小鼠血脂代謝的影響

如表4所示，空白對照組、乳清蛋白對照組及JOPs干預的3組小鼠血清TC值均顯著低于DM模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;空白對照組及JOPs-MG小鼠的血清TG顯著低于DM模型對照組（P<0.05）;JOPs干預的3組小鼠血清HDL-C均顯著高于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型對照組小鼠的血清LDL-C含量與其他組相比差異無統(tǒng)計學差異。

3 討論

探究JOPs血糖調節(jié)作用的研究基礎首先需要依賴于DM動物模型。目前國內外主要使用的DM模型動物主要分為自發(fā)性模型動物、轉基因模型動物和誘發(fā)性模型動物等。在諸多動物模型中，db/db小鼠是屬于自發(fā)性模型動物中比較優(yōu)質的用來研究2型DM的模型小鼠，價格也比較昂貴，它是由C57BL/KsJ近親交配株常染色體隱性遺傳衍化而來。純合的自發(fā)突變小鼠在3～4周齡時產(chǎn)生可以辨認的肥胖表型;出生后10～14日，血漿胰島素和血糖開始升高，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿的“三多”癥狀，其存活壽命為10個月左右。db/db小鼠的DM發(fā)生發(fā)展近似人類DM病理改變過程，適合用于外物干預下的DM降糖作用研究，模型持續(xù)時間長，可為后續(xù)的研究奠定穩(wěn)固的基礎[13]。對于DM的治療來說，控制好FPG是最基礎的方向，F(xiàn)PG的降低可以延緩或抑制DM的進一步惡化，對于防治DM并發(fā)癥也有很好的效果[14-16]。本研究中，JOPs干預后的3組db/db小鼠的FPG均顯著低于模型對照組（P<0.05），甚至在數(shù)值上比陽性對照組二甲雙胍的血糖值更低，說明JOPs可以有效降低FPG，長期干預下可能效果優(yōu)于二甲雙胍。同時，JOPs干預后3組的FPG也顯著低于乳清蛋白對照組，意味著JOPs在乳清蛋白對照組平衡了膳食蛋白攝入量的情況下依然顯示出突出的降糖效果，說明體現(xiàn)出了BAP比普通參照蛋白具有更強的活性優(yōu)勢。

胰島素是機體調節(jié)血糖水平的重要蛋白質激素，與血糖水平密切相關。IR是2型DM的發(fā)病基礎[17]，指胰島素作用的靶器官對胰島素的敏感性下降，使胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降的狀態(tài)。研究結果中雖然INS絕對水平在各組間無顯著差異，但經(jīng)計算了HOMA-IR指數(shù)后可發(fā)現(xiàn)，JOPs-HG小鼠HOMA-IR指數(shù)顯著低于模型對照組，說明JOPs最高劑量下可有效改善IR，對于控制血糖、控制DM進展有重要意義。

IR主要的誘因有遺傳因素、肥胖、炎癥反應、氧化應激增加等。其中，炎癥反應是2型DM、IR、心血管疾病以及肥胖等狀態(tài)的共同交集，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[18-19]。IL-6是目前被認為最具內分泌特征的細胞因子，不僅由免疫活性細胞產(chǎn)生，也由脂肪細胞產(chǎn)生，參與機體炎癥反應及能量代謝。IL-6可參與機體炎癥反應并通過與胰島素的相互作用影響DM的發(fā)生和發(fā)展[20]。同時，IL-6還可與TNF-α等因子相互作用共同參與炎癥反應，加速DM的發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)，DM患者空腹血清IL-6和TNF-α水平明顯升高。TNF-α是一種非糖基化蛋白，巨噬細胞、中性粒細胞等多種細胞均可合成，有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在IR的動物脂肪組織中過度表達[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，JOPs可顯著降低血清IL-6和TNF-α，提示JOPs可能通過調節(jié)炎癥反應來改善IR。除了IL-6和TNF-α這兩個重要的炎癥因子以外，IL-8可通過對中性粒細胞有細胞趨化作用而實現(xiàn)其對炎癥反應的調節(jié);IL-10作為抑炎因子，有研究發(fā)現(xiàn)，在飲食誘導脂肪性肝病的動物模型中，抑制IL-10可使促炎細胞因子的表達增加、胰島素信號傳導惡化以及糖異生的激活[23];而CRP與 2型DM及其并發(fā)癥密切相關，是2型DM發(fā)病的最強的預測因子[24-25]。但本研究未發(fā)現(xiàn)JOPs干預對IL-8、IL-10、CRP有顯著影響。這可能與JOPs的作用靶點有關，有待進一步深入研究闡明。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，在血脂代謝方面，JOPs有效降低了血清TC、TG，同時升高了HDL-C水平，說明JOPs可一定程度地促進脂類的代謝，改善脂質紊亂，顯著降低DM大鼠的血脂水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，JOPs具有降血糖、降血脂以及調節(jié)機體炎癥反應的作用，推測JOPs通過調節(jié)炎癥因子改善IR從而有效降低血糖。由于國內外尚無關于JOPs的相關研究，因此，本研究具有一定的獨創(chuàng)性。隨著近年來BAP領域的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)許多BAP類都具有降血糖的作用[3-4，26-27]。JOPs從結構基礎來講，比蛋白質和多肽更易消化，吸收速度甚至高于氨基酸，可減輕腎臟代謝負擔，具有獨特的生理功能和理化性質，是蛋白質或氨基酸所不具備的，具有重要的科學意義和臨床應用價值。

4 結論

本研究以db/db小鼠為DM模型小鼠，設立不同劑量的JOPs干預組和多種對照組，探討JOPs對DM小鼠血糖、血脂和炎癥反應的調節(jié)作用，結果顯示，JOPs具有降低DM小鼠FPG、HOMA-IR指數(shù)的作用，同時還可使血清IL-6、TNF-α、TC和TG顯著降低，并使HDL-C顯著升高，這對于降低DM患者血糖及防治DM有重要意義。

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Abstract：Objective To study the effects of jackfruit oligopeptides（JOPs）on inflammation，glucose and lipid in db/db diabetic mice.Method Totally 48 db/db diabetic mice were randomly divided into six groups （8 in each groups） including three jackfruit oligopeptides groups（treated orally with 0.2，0.4 and 0.8 g/kg·BW JOPs），diabetic model group（treated orally with distill water），positive control group （treated orally with 0.2 g/kg·BW metformin hydrochloride enteric-coated tablets aqueous solution）and whey protein control group（treated orally with 0.4 g/kg·BW whey protein aqueous solution），while 8 db/m mice were used as blank control for non-diabetic mice.FPG，INS，inflammatory cytokines and serum lipid metabolism were measured after 6-months intervention.Result JOPs could significantly reduce FPG，HOMA-IR，IL-6，TNF-α，TC and TG while HDL-C increased significantly.Conclusion JOPs have a hypoglycemic effect in db/db mice and its mechanism is related to improving insulin resistance by regulating inflammatory cytokines.

Keywords：jackfruit oligopeptides（JOPs）;insulin resistance;inflammation;db/db diabetic mice

（責任編輯 李婷婷）