樊蕊 郝云濤 劉欣然 胡佳妮 徐美虹 李勇

摘?要：目的：評價人參低聚肽（GOP）改善老齡db/db小鼠血糖水平和延長壽命的效果。 方法：采用db/db小鼠作為2型糖尿病模型。對老齡db/db（生長至70周齡）小鼠攝食量、體重、飲水量和尿量以及血糖水平進行測定，并且對老齡db/db小鼠存活率進行評價，表征GOP對疾病狀態(tài)和壽命的改善效果。結(jié)果：GOP可以降低小鼠體重、攝食量、飲水量和尿量，改善老齡db/db小鼠的生存狀態(tài)，同時，相比于模型對照組，GOP可以顯著減少老齡db/db小鼠腎周脂肪指數(shù)和睪周脂肪指數(shù)（P<0.05）。通過GOP干預(yù)，可以降低老齡db/db小鼠的血糖水平，GOP干預(yù)組AUC為20mmol/（L·h），顯著低于模型對照組小鼠AUC[50 mmol/（L·h）]。當db/db小鼠增長至80周齡時，GOP干預(yù)組小鼠存活率為50%，大于模型對照組存活率（20%）。結(jié)論：GOP干預(yù)小鼠生存質(zhì)量較高，并且壽命較長，說明GOP可以在一定程度上改善老齡db/db小鼠血糖情況，延長其壽命。本研究為利用GOP開展糖尿病的營養(yǎng)治療提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：db/db小鼠;老齡;人參低聚肽;血糖;壽命

隨著社會發(fā)展和人們生活水平的提高，2型糖尿病的患病率逐漸上升，糖尿病并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)是繼心腦血管和癌癥后發(fā)達國家中的第三位，引起了全球重視[1]。db/db 小鼠的發(fā)病機制類似于人類 2 型糖尿病，是研究人類 2 型糖尿病的理想動物模型[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，人參具有良好的降血糖作用。尚文斌等[3]研究發(fā)現(xiàn)，人參達到降糖作用是通過可增加胰島素敏感性、抑制基礎(chǔ)脂分解實現(xiàn)的。張南等[4]研究證實，人參與刺加五配伍提取物可促進胰島素分泌、改善機體對胰島素的敏感性。低聚肽是指由10個及以下氨基酸組成的小分子肽，可直接被人體吸收，并且能夠直接參與蛋白質(zhì)的合成，提高機體對蛋白質(zhì)的利用率。目前針對GOP的研究相對較少，本課題組之前的研究證明GOP具有調(diào)節(jié)血糖的功能[5]，但對于其改善db/db小鼠的糖尿病以及對其壽命的延長并未有所報道。本實驗以前期實驗為基礎(chǔ)，采用GOP調(diào)節(jié)血糖的有效劑量對db/db小鼠進行干預(yù)，觀察GOP的降血糖效果，以及延長db/db小鼠壽命的功效。

目前學(xué)者對于db/db小鼠生命特征的研究多集中在20周齡以下，而對于db/db小鼠生命特征和生存質(zhì)量并未見報道，同時對于該模型小鼠的實際壽命的報道結(jié)果不一。在對糖尿病以及糖尿病患者的研究中，糖尿病患者的生存狀態(tài)是研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵問題和難點問題。在目前GOP對糖尿病小鼠生存狀態(tài)研究空白下，本研究對db/db小鼠喂養(yǎng)終生，對其期間的生存狀態(tài)以及生存質(zhì)量予以探析，評價其改善db/db小鼠血糖的效果，以期對充分恰當?shù)膽?yīng)用該模型小鼠提供科學(xué)依據(jù)，同時為開展糖尿病的營養(yǎng)治療提供新思路和參考。

1?材料與方法

1.1?實驗動物與受試物

選取45只空腹血糖水平≥11.1mmol /L 的db /db 小鼠，按空腹血糖水平隨機分為3組：1 個模型對照組、?1個陽性對照組[鹽酸二甲雙胍腸溶片225mg /kg·BW]、1 個GOP干預(yù)組（0.50 g/kg·BW），每組15只。另取15只db /m 小鼠作為正常對照組，各組小鼠均給予普通飼料，自由飲食、飲水。每天灌胃1次，飼養(yǎng)實驗室符合國標清潔級，溫度（25±1）℃，相對濕度50%～60%，室內(nèi)照明控制在12 h /12 h 光暗周期節(jié)律。持續(xù)飼養(yǎng)，終生干預(yù)。飼養(yǎng)至70w以后，進行各項指標檢測。

GOP，由吉林肽谷生物工程有限責任公司提供。GOP為淺黃色固體粉末，利用生物酶解、超濾技術(shù)從人參中分離得到的小分子活性肽的混合物。經(jīng)HPLC?MS分析，混合物中小分子低聚肽的質(zhì)量分數(shù)高達95%以上。

1.2?儀器

安穩(wěn)血糖儀，三諾公司;安穩(wěn)血糖試紙，三諾公司。

1.3?;指標測定

（1）動物一般狀態(tài)觀察及體格指標測定：每周觀測并記錄動物活動情況、毛發(fā)光澤、攝食和飲水量、體重。（2）尿液收集：將正常飼養(yǎng)71、75、79、83w的小鼠置于代謝籠中，收集24h 尿液，尿液采集后，立即混勻，測定體積。（3）脂肪和腓腸肌指數(shù)：各組小鼠飼養(yǎng)臨近至壽命終點時，小鼠稱重后脫頸椎處死，無菌快速分離腎周脂肪、睪周脂肪，剝離腓腸肌，稱重;計算脂肪系數(shù)和腓腸肌系數(shù)。[腓腸肌/脂肪指數(shù)=臟器重（g）/體重（kg）×100%]。（4）隨機空腹血糖檢測：每隔4w監(jiān)測隨機空腹血糖，測定前禁食6h，測定時剪尾取血，采用血糖儀測定及記錄。（5）糖耐量實驗觀察指標及檢測：將飼養(yǎng)80w的小鼠在測定前1d禁食12h（自由飲水），禁食結(jié)束時灌胃給予葡萄糖溶液（50%質(zhì)量分數(shù)），劑量為4μg/g· BW，測定給葡萄糖后0、0.5、1、2h 的血糖值，并按式（1）計算血糖曲線下面積。

血糖曲線下面積（AUC）=1/2×（0h 血糖值+0.5h 血糖值）×0.5+1/2×（0.5h 血糖值+1h 血糖值）×0.5+1/2×（1h 血糖值+2h 血糖值）×1（1）

1.4?統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析，差異顯著者進行方差齊性檢驗。以P<0.05 為差異顯著性標準。

2?結(jié)果與分析

2.1?老齡糖尿病小鼠體重和攝食量的變化

由圖1可以看出，老齡db/db小鼠隨著生長周齡的增加，其攝食量呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢，而模型對照組的小鼠攝食量曲折增加。從整體情況來看，模型對照組小鼠的攝食量顯著高于正常對照組、陽性對照組和GOP干預(yù)組。老齡db/db小鼠隨著生長周齡的增加，各組小鼠體重呈現(xiàn)下降趨勢。從整體趨勢來看，4組小鼠的體重高低順序依次為：模型對照組>GOP干預(yù)組>陽性對照組>正常對照組。其中，模型對照組小鼠的體重顯著高于正常對照組。

2.2?老齡糖尿病小鼠飲水量和尿量的變化

由表1可知，從整體趨勢看，干預(yù)期間隨著小鼠周齡的增加，各組小鼠飲水量無明顯變化，其中模型對照組小鼠飲水量顯著高于正常對照組、陽性對照組和GOP干預(yù)組（P<0.05）。同樣，各組老鼠的尿量的變化情況與飲水量相似，整個干預(yù)期間，變化量不明顯，但從整體而言，模型對照組的小鼠尿量顯著高于正常對照組、陽性對照組和GOP干預(yù)組（P<0.05），其分別是正常對照組、陽性對照組和GOP干預(yù)組的4、2.5、1.5倍。

2.3?老齡糖尿病小鼠脂肪和腓腸肌系數(shù)

由圖2可以看出，模型對照組小鼠的腎周脂肪和睪周脂肪的指數(shù)均大于正常對照組、陽性對照組和GOP干預(yù)組，其中與正常對照組和陽性對照組之間存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而模型對照組腓腸肌系數(shù)最低，顯著低于模型對照組和陽性對照組（P<0.05）。

2.4?老齡糖尿病小鼠血糖變化情況

由表2可以看出，隨著周齡的增加，僅僅模型對照組小鼠空腹血糖呈現(xiàn)下降趨勢，其余組未呈現(xiàn)規(guī)律變化。從整體趨勢來看，4組中血糖最高的為模型對照組，其余各組未呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。由圖3a可知，正常對照組、GOP干預(yù)組和陽性對照組的小鼠灌胃葡萄糖后，血糖呈現(xiàn)先增加會降低的趨勢，而僅僅模型對照組的血糖趨勢并未呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，并且模型對照組血糖水平高于其余3組。通過圖3b可以看出，各個組AUC大小依次為：模型對照組>陽性對照組>GOP干預(yù)組>正常對照組，并且模型對照組血糖曲線下面積（AUC）顯著大于正常對照組、陽性對照組和GOP干預(yù)組（P<0.05）。

2.5?糖尿病小鼠存活率

由圖4可以看出，隨著小鼠周齡的增加，其存活率下降。當小鼠小于79周齡時，正常對照組小鼠存活率恒定為100%，GOP干預(yù)組和模型對照組的存活率雖然有所降低，但降低緩慢，當大于81周齡后，正常對照組小鼠開始出現(xiàn)死亡，其存活率始終恒定為80%，而模型對照組小鼠存活率低于20%，GOP干預(yù)組小鼠的存活率也大幅度下降，氮氣仍保留在50%左右。綜上發(fā)現(xiàn)，GOP干預(yù)組和陽性對照組小鼠的壽命長于模型對照組小鼠，說明GOP和二甲雙胍干預(yù)均能一定程度延長老齡db/db小鼠壽命。

3?討論

db/db 小鼠是美國 Jackson 實驗室在 1966 年從C57BL/6J 小鼠中篩選出的一株突變系，該小鼠突變基因（db）位于 4 號染色體，由于長鏈瘦素受體 Ob/Rb 被替換成了短鏈瘦素受體 Ob/Ra，導(dǎo)致具有自發(fā)糖尿病特性，純合子（db/db）小鼠是研究人類 2 型糖尿病的理想動物模型，其肥胖、高血糖、高血脂和胰島素抵抗等癥狀于出生4w后開始出現(xiàn)，隨后血糖持續(xù)升高，直至出現(xiàn)慢性并發(fā)癥和胰島 β 細胞功能衰竭，10 個月左右死亡[6?7]。 圖1顯示，模型對照組小鼠體重顯著高于正常對照組小鼠，而圖2也可以發(fā)現(xiàn)，模型對照組腎周脂肪和睪周脂肪含量也顯著高于正常對照組小鼠。而通過表1～2也可以看到，模型對照組小鼠飲水量和尿量顯著高于正常對照組小鼠，可見即使老齡db/db小鼠仍然具有典型的多飲、多食、多尿、肥胖等癥狀。同時通過圖1、表1、圖2可以發(fā)現(xiàn)，通過干預(yù)，陽性對照組和GOP干預(yù)組的小鼠的體重較模型對照組有了改善，同時攝食量、飲水量和尿量也有了明顯的降低，說明GOP可以顯著改善db/db小鼠多食、多飲、多尿的癥狀，同時改善db/db小鼠肥胖的狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過GOP進行干預(yù)，小鼠空腹血糖有所降低，其對db/db小鼠改善血糖的效果與二甲雙胍相當，并且GOP干預(yù)組小鼠的糖耐量顯著改善，其AUC顯著低于模型對照組小鼠，且效果優(yōu)于陽性對照組。早在1980年，日本學(xué)者Ando[8]從人參中發(fā)現(xiàn)了一個14肽，隨后證實其具有治療糖尿病的效果。國內(nèi)學(xué)者也得到過相似結(jié)論，王本祥等[9]通過研究人參多肽灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)其能降低正常小鼠的血糖和肝糖原。據(jù)推測，GOP降低血糖的機制可能與其富含精氨酸相關(guān)，研究表明，精氨酸能有效改善胰島素抵抗及血脂代謝紊亂[10]。

對于db/db小鼠壽命的報道，本研究取得了重大突破，文獻報道，純合子糖尿病小鼠db/db于3～8周齡時開始貪食及發(fā)胖，體重快速增加，屬于肥胖型高血糖糖尿病模型。一般在10個月內(nèi)死亡，其平均壽命約為?6～8個月，但也有個別報道，其可以活到12月齡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，無論db/db小鼠或db/m小鼠，其壽命均顯著長于文獻報道的12個月。本研究發(fā)現(xiàn)，即使不經(jīng)過任何干預(yù)，自然生長的db/db小鼠70周齡的生存率為78%。而通過GOP干預(yù)，其壽命延長，70周齡的生存率為83%，生長至80周齡，其存活率仍為50%，顯著高于模型對照組的生存率19%。劉清秀[12]證實了紅參蛋白可以延長果蠅壽命。張婉迎等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人參水提物可以顯著延緩果蠅衰老，延長其壽命。劉光潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿在一定程度上通過改善脂類代謝紊亂和肝功能來顯著改善db/db小鼠的衰老進程。

綜上所述，GOP可以改善老齡db/db小鼠的血糖及糖耐量，并且在一定程度上延長其壽命，但是GOP降低血糖的的作用機制將在后續(xù)實驗中開展研究，對于GOP對db/db小鼠壽命的延長機理值得進一步探討。◇

參考文獻

[1]Ogurtsova K，Da R F J D，Huang Y，et al.IDF diabetes atlas：global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040[J].Diabetes Research and Clinical Practice，2017（128）：40?50.

[2]Kobayashi K，F(xiàn)orte T M，Taniguchi S，et al.The db/db mouse，a model for diabetic dyslipidemia：molecular characterization and effects of Western diet feeding[J].Metabolism，2000，49（1）：22?31.

[3]尚文斌，楊穎，姜博仁，等.人參皂甙Rb?1 促進3T3?L1 脂肪細胞分化并抑制脂解[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2007，23（3）：258?263.

[4]張南，李娜，李佳琳，等.人參、刺五加提取物對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的降糖作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26（10）：1690?1695.

[5]孫彬，李迪，毛瑞雪，等.吉林人參低聚肽對糖尿病大鼠的降血糖作用研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2016，22（10）：62?65.

[6]Garris D R.Gonadal steroid modulation of the diabetes（db/db）?indueed hyperlipometabolic，hypogonadal syndrome：Restoration of female reproductive tract cytochemical and struetural indices[J].Pathophysiology，2005，12（2）：19?20.

[7]Garris D R.Estrogenie stimulation of ovarian follicular maturation in diabetes（db/db）mutant mice：restoration of euglycemia prevents hyperlipidemic cytoatrophy[J].Cell Tissue Res，2004，318（2）：231?242.

[8]Ando T，Muraoka T，Yamasaki N，et al.Preparation of anti?lipolytic substance from panax ginseng[J].Planta Medica，1980，38（1）：18?23.

[9]王本祥，楊明，金玉蓮，等.人參多肽降血糖作用[J].藥學(xué)學(xué)報，1990（6）：401?405.

[10]朱小鵬，顏紅梅，常薪霞，等.精氨酸刺激試驗評估胰島β細胞1相分泌功能的價值及對2型糖尿病治療的指導(dǎo)作用[J].中國臨床醫(yī)學(xué)，2017，24（4）：548?553.

[11]田小蕓，董敏，趙志剛，等.自發(fā)性糖尿病小鼠C57BL/KsJ?db/db某些臟器組織病理學(xué)觀察[J].實驗動物科學(xué)，2011，28（1）：22?24.

[12]劉清秀.紅參抗衰老組分研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[13]張婉迎，趙文學(xué)，尹翌秋，等.人參水提物對果蠅抗衰老的作用機制[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，40（5）：557?562.

[14]劉光潔，劉光澤，蘭丹，等.甜菜堿對老齡db/db小鼠脂肪性肝損害的影響[J].中國病理生理雜志，2013，29（6）：1114?1118.

[15]任金威，李迪，孫靖琴，等.吉林人參低聚肽對小鼠耐缺氧作用的研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2018，24（12）：54?57.

Improving Effects of Ginseng Oligopeptide on Disease State and Prolonging Life in Aging db/db Mice

FAN Rui，HAO Yun?tao，LIU Xin?ran，HU Jia?ni，XU Mei?hong，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：?Objective To get the evaluation of ginseng oligopeptides （GOP）improved blood glucose levels in aging db/db mice and prolong life in older db/db mice. Method We used db/db mice as a type 2 diabetes model.The food intake，body weight，water intake and urine volume，and blood glucose levels of db/db growth to 70 weeks old were measured，and the survival rate of db/db mice was evaluated，which were used to characterize the effects of GOP on the disease state and life span in db/db mice. Result GOP could decrease the body weight，food intake，water intake and urine output of mice，improve the survival status of aging db/db mice，and the perirenal and testis fat index in GOP intervention group were lower than those in the model group （P<0.05）.The blood glucose level of in the GOP intervention group showed the relative lower，and the AUC of the GOP intervention group was 20 mmol/（L·h），which was significantly lower than that of the model control group[50 mmol/（L·h）].When the db/db mice grew to 80 weeks，the survival rate of the GOP intervention group was 50%，which was larger than that in the model control group （20%）. Conclusion The quality of life of GOP intervention mice was higher and the lifespan was longer，which indicated that GOP could improve the blood glucose status and prolong the life of aging db/db mice.This paper provided a theoretical basis for the use of ginseng oligopeptides for the nutritional treatment of diabetes.

Keywords：db/db mice;aging;ginseng oligopeptide（GOP）;blood sugar;life span