董俊杰 施琪浩 張英杰

摘 ? ? ?要：蘿卜硫素（SFN）是蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌效果最好的植物活性物質(zhì)。采用DFT方法在B3YLYP/6-31+G水平下計算蘿卜硫素及其衍生物的羰基氧5-O的ESP電荷、NBO電荷、HIR電荷和Mulliken電荷，通過用不同的基團(tuán)單取代得到17種不同衍生物，利用Chem 3D軟件模擬了17種不同取代基的蘿卜硫素衍生物的沸點(diǎn)，并通過擬合發(fā)現(xiàn)羰基氧5-O的NBO電荷值的相關(guān)系數(shù)值較大（R2=0.951，y=1 028.24+1 080.58x），利用信息理論指數(shù)擬合的羰基氧5-O的SGBP值的相關(guān)系數(shù)值最大（y=25.13+1.60x，R2=0.980）。還模擬了蘿卜硫素及其-F代衍生物的質(zhì)譜，對其譜圖中的特征峰進(jìn)行指認(rèn)和歸屬，這對蘿卜硫素及其衍生物的酶法合成提供了理論支持，也為材料工程與制藥專業(yè)拓展實(shí)驗(yàn)識別其蘿卜硫素衍生物以及構(gòu)效關(guān)系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān) ?鍵 ?詞：制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn);密度泛函理論 ;蘿卜硫素;沸點(diǎn);質(zhì)譜;譜學(xué)分析

中圖分類號：G822.8 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）08-1643-04

Abstract： Sulforaphane （SFN） is the most potent anticancer plant active substance found in vegetables. The ESP charge， NBO charge， HIR charge and Mullliken charge of carbonyl oxygen 5-O of sulforaphane and its derivatives were calculated by DFT method at B3YLYP/6-31+G level. Seventeen different derivatives were obtained by single substitution of different groups. The boiling points of 17 different substituted sulforaphane derivatives were simulated by Chem3D software， and the correlation of the NBO charge of carbonyl oxygen 5-O was found by fitting. The value was larger （R2 = 0.951， y=1 028.24 + 1 080.58x）， and the correlation coefficient of SGBP value of carbonyl oxygen 5-O fitted by information theory index was the largest （y=25.13 + 1.60x， R2 = 0.980）. The mass spectra of sulforaphane and its derivatives were simulated， and the characteristic peaks were identified and assigned. This paper can provide a solid theoretical support for the enzymatic synthesis of sulforaphane and its derivatives， as well as basic data for the identification of sulforaphane derivatives and their structure-activity relationships in materials engineering and pharmaceuticals.

Key words： Pharmaceutical experiments; DFT; SFN; Boiling points; Mass spectroscopy; Spectral analysis

目前，胃癌等惡性腫瘤是世界上尤其老年人癌癥正逐漸地演變成第一大導(dǎo)致死亡的原因，高發(fā)病率和高致死率的疾病之一，全球每年因胃癌而死亡的病人總數(shù)達(dá)到了千萬人次以上。用化學(xué)方法防治癌癥已經(jīng)引起人們的關(guān)注。蘿卜硫素（1-異硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷） （Sulforaphane），又稱“萊菔硫烷”，是一種異硫氰酸鹽，由硫代葡萄糖苷（glucosinlates以下簡稱硫苷， SFN）經(jīng)植物體內(nèi)黑芥子酶（myrosinase enzyme）水解所得。在西蘭花、芥藍(lán)、北方圓紅蘿卜等十字花科植物中含量較豐富，是常見抗氧化劑，是蔬菜中所發(fā)現(xiàn)的抗癌效果最好的植物活性物質(zhì)。蘿卜硫素是一種含硫化合物，由硫苷經(jīng)黑芥子酶水解而成，常溫下呈黃色或者無色液體，不溶于水，但是極易溶解于甲醇、二氯甲烷、乙腈等有機(jī)溶劑，在高溫和堿性條件下易分解，相對分子質(zhì)量為177.3，分子式C6H11S2NO。硫苷和黑芥子酶分別穩(wěn)定存在于植物組織細(xì)胞和液泡中，只有當(dāng)植物組織被破壞時才能水解得到蘿卜硫素。由于水解過程會受pH、溫度、水分等因素影響，往往會造成蘿卜硫素產(chǎn)量降低。盡管自然酶解法易受外界壞境影響，但可以根據(jù)蘿卜硫素的化學(xué)特性，創(chuàng)造有利于合成蘿卜硫素的酶解環(huán)境，如適宜的酶解pH=5～7，有利于合成蘿卜硫素。目前已在植物中發(fā)現(xiàn)120 多種硫苷，十字花科作物中硫苷含量最高，植株各個部分都有分布，尤其是種子中的含量最高。植物體內(nèi)硫苷含量會受外界生長環(huán)境的影響，因此蘿卜硫素含量也受到外界環(huán)境條件的影響。不同植物種類其硫苷含量也不同，一般蕓薹屬蔬菜中硫苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為500～2 000μg·g-1，其中青花菜中含量最高，尤其是種子和幼苗中，其硫苷含量是成熟植株的10～100 倍。因此青花菜是提取蘿卜硫素的理想原料。研究表明蘿卜硫素主要分布在十字花科蔬菜中。采用50、70和90 ℃ 3種不同溫度常壓干燥9種十字花科蔬菜食用部位， 采用HPLC測定其蘿卜硫素含量。結(jié)果顯示， 該9種十字花科蔬菜中蘿卜硫素含量是蕓薹屬>蘿卜屬; 蕓薹屬中青花椰菜蘿卜硫素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高， 為480μg·g-1， 花椰菜質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為35.2μg·g-1; 蘿卜屬中胡蘿卜的蘿卜硫素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高， 為80.9μg·g-1， 白蘿卜質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低， 為19.8 μg·g-1; 而在這3種不同干燥溫度對同一樣品處理中， 90 ℃烘干樣品中蘿卜硫素含量最高。 蘿卜硫素（SFN， 圖1） 是其中抗癌活性最強(qiáng)的一種植物提取單體藥物。

2019年6月，張雪映等研究了蘿卜硫素（SFN）作為內(nèi)源性抗氧化的誘導(dǎo)劑， 在炎性疾病和脂肪肝疾病中參與氧化應(yīng)激和化學(xué)保護(hù)， 表現(xiàn)出多種生理活性。為抗腫瘤新藥研發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。2019年6月，陳娜等對花椰菜蘿卜硫素是否對人體具有降糖作用， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 花椰菜蘿卜硫素具有輔助人體降糖的作用[2]。2019年6月，楊艷華等針對蘿卜硫素對人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究， 結(jié)果表明蘿卜硫素能夠顯著抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖， 促使其凋亡， 表現(xiàn)出時間和劑量依賴性， 蘿卜硫素還能將SGC-7901細(xì)胞停留在G1期[3]; 2019年1月，馮莉芳等針對蘿卜硫素對人胃癌細(xì)胞HGC27的抑制作用及其機(jī)制研究，探討蘿卜硫素對人胃癌細(xì)胞HGC27的抑制作用及其可能的作用機(jī)制[4-7]。本文將采用密度泛函理論（DFT）的方法，對其進(jìn)行一元取代，得到結(jié)構(gòu)不同的衍生物，利用Chem 3D 8.0分別模擬計算及其衍生物的沸點(diǎn)，并計算模擬沸點(diǎn)與電荷值之間的線性關(guān)系，得到相關(guān)性最高的關(guān)于沸點(diǎn)的預(yù)測方程。這一方法對于研究SFN的物化性質(zhì)有著重要作用[8-9]。質(zhì)譜廣泛應(yīng)用于各個學(xué)科領(lǐng)域檢測鑒定各種化合物。隨著各種新型電離技術(shù)的發(fā)展， 質(zhì)譜（MS）技術(shù)已經(jīng)成長為現(xiàn)代測試最有前途的分析手段之一， 尤其是在檢測生物大分子及藥物大分子等方面得到了極其廣泛的應(yīng)用和普及。本文對蘿卜硫素質(zhì)譜模擬，并對質(zhì)譜上的特征峰進(jìn)行指認(rèn)和歸屬，這對蘿卜硫素及其衍生物結(jié)構(gòu)的研究提供有利的借鑒。

1 ?計算方法

在Chem Draw 8.0軟件內(nèi)畫出苯妥英的平面結(jié)構(gòu)圖，啟動Chem 3D 8.0軟件，將Chem Draw 8.0畫好的平面結(jié)構(gòu)復(fù)制到Chem 3D 8.0中，并將苯妥英分子變成球棍模型，點(diǎn)擊能量最低化按鈕，讓其優(yōu)化到分子勢能最低。保存其分子結(jié)構(gòu)，保存為mol格式文件并命名。再將其導(dǎo)入GaussView 5.0.9軟件中，得到的就是其立體結(jié)構(gòu)。圖1為蘿卜硫素平面結(jié)構(gòu)圖。在分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，用取代基-R為-F，-Cl，-CH2Cl，-NO2，-CN，-CH3，-C2H5，-C（CH3）3，-OCH3，-CHO，-COCH3，-COCH2CH3，-OH，-CH2OH，-COOH，-COOCH3，-OCOCH3進(jìn)行一元取代，從而得到17種不同的SFN衍生物。打開GaussView，在菜單欄中選擇Gaussian Calculate Setup，在 Job Type 中選擇Energy，選用方法為DFT， 基組選用6-31+G，其他保持不變。在Title自定義標(biāo)題。在General中將Write Connectivity的勾去掉。在Additional Keywords中輸入關(guān)鍵詞pop=（nbo， chelpg， hirshfeld）。在Link 0的Memory Limit選擇Specify， 60MV，Chkpoint File選擇Dont save，其他保持不變，然后點(diǎn)擊下方的Submit，彈出框中點(diǎn)擊Save，保存gif文件，然后save，再點(diǎn)擊OK，等待計算結(jié)果。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?SFN及其衍生物的原子電荷及沸點(diǎn)模擬

打開Chem 3D，將模擬的SFN分子導(dǎo)入Chem 3D中，選擇菜單欄Analyze，點(diǎn)擊Compute Properties，待彈出窗口選擇Boiling Point（TB），點(diǎn)擊OK，得出的為沸點(diǎn)。將17種衍生物導(dǎo)入Chem3D中，并用相同的方法計算模擬，得到沸點(diǎn)。打開GaussView，打開Gaussian Calculate Setup窗口，在Job Type中選擇NMR，選用的方法為Hartree-Fock，選擇6-31+G基組，自定義標(biāo)題。General中將Write Connectivity勾去掉。在Link 0的Memory Limit選擇Specify， 60MV，Chkpoint File選擇Dont save，然后點(diǎn)擊下方Submit，點(diǎn)擊Save，保存命名為“1-nmr.gif”，save，再點(diǎn)擊OK，等待計算結(jié)果。對衍生物進(jìn)行相同計算方法，得到不同質(zhì)譜圖。利用GaussView計算SFN及17種衍生物羰基氧上NBO，HIR，ESP和Mulliken電荷值，利用Chem 3D 8.0軟件對SFN及17種衍生物的沸點(diǎn)進(jìn)行模擬，結(jié)果如表1所示。為了直觀表示出電荷值的變化與沸點(diǎn)之間的關(guān)系，分別對羰基氧5-O的HIR，ESP，Mulliken和NBO的電荷值與沸點(diǎn)進(jìn)行線性作圖分析，從而進(jìn)一步確認(rèn)它們之間的關(guān)系。根據(jù)以上4幅圖可以對比發(fā)現(xiàn)，在其4個擬合線性方程中，羰基氧5O-NBO電荷值與沸點(diǎn)的線性方程的R值較大（R2 = 0.951， ?y =1 028.24 +1 080.58x）。

2.2 ?SFN及其衍生物的信息指數(shù)分析

信息理論（IT）作為數(shù)學(xué)、微電子學(xué)以及PC機(jī)的一個小分支學(xué)科，它首先由英國數(shù)學(xué)家申農(nóng)（Shannon）等把描述概率分布的函數(shù)-信息（Information）-定量化而逐步發(fā)展起來的。因?yàn)镮T函數(shù)量僅僅與分子中的原子電子密度及其梯度量有關(guān)聯(lián)，都是它們卻與密度泛函（DFT）理論和密度泛函化學(xué)活性理論（DFRT）有著天然的、緊密的內(nèi)在的有機(jī)聯(lián)系。將引入以下9個IT信息理論量來描述目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)與活性，進(jìn)一步發(fā)展DFRT理論：香農(nóng)信息熵（SS）：描述電子密度的空間離散程度。費(fèi)舍爾信息熵（IF）：描述電子密度分布的銳度和濃度。費(fèi)舍爾信息-拉普拉斯量的等價表示（IFL）： GBP熵（SGBP）;信息增益量（IG）：兩個概率分布函數(shù)的熵差的非對稱性量度;Hirshfeld原子電荷（Hirshfeld charge）： Rényi信息熵（Rn）：當(dāng)n趨近1的時候，Rn演變?yōu)橄戕r(nóng)信息熵Ss。Tsallis信息熵（Tn），延展化的標(biāo)準(zhǔn)玻茲曼-吉布斯信息熵（Boltzmann-Gibbs entropy）;Onicescu信息能（En），較SS更精確的描述離差分布的物理量。以上9個IT信息熵量，均可以以分子中的原子與電子密度極其梯度作為數(shù)學(xué)概率分布函數(shù)的變量來定義的一系列IT信息理論物理量。使用 Chem 3D 軟件， 構(gòu)建 17個蘿卜硫素酸及其衍生物的模型， 并使用 ChemDraw 8.0 進(jìn)行其能量最低化; 在 GaussView 5.0.9 軟件中， 對其進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化， 并保存其mol格式和gif格式， 在菜單欄中選擇 Calculate-Gaussian Calculate Setup， 分別計算17個衍生物的量化參數(shù)。運(yùn)用 ACD Labs 6.0 軟件， 得到17個蘿卜硫素衍生物相對應(yīng)的沸點(diǎn)預(yù)測值; 再用 Multiwfn 3.5 分別計算 17個衍生物的信息分子熵， 記錄其所需O、H原子的熵值。最后分別將17個衍生物O、H原子的8種的熵值與得到的沸點(diǎn)（TB）用 Origin 8.6作圖， 得到相應(yīng)線性回歸方程， 比較其相關(guān)系數(shù) （R）值的大小， 確定值最大為尋找得到的預(yù)測方程。研究結(jié)果（表2）顯示，氧原子GBP熵（SGBP）值與其沸點(diǎn)的線性相關(guān)系數(shù)最佳，R2=0.980，y=25.13+1.60x）。

2.3 ?SFN及其-F代衍生物的質(zhì)譜分析

商品化的質(zhì)譜儀（MS）用高能分子-電子能流等去轟擊分子樣品，使該目標(biāo)分子失去外層電子變?yōu)閹Р煌姾傻姆肿与x子極其鍵裂解碎片離子。這些不同的帶電荷的正離子將具有不同的分子質(zhì)量，而質(zhì)量不同的正離子將在外電磁場的引導(dǎo)作用下到達(dá)分子離子檢測器的時間也將不同，其飛行結(jié)果即為目標(biāo)分子的MS質(zhì)譜圖。選擇離子檢測方式是預(yù)先選定1種或2～3種特征離子進(jìn)行掃描，得出這些質(zhì)荷比的離子流強(qiáng)度隨時間變化的圖形-特征離子色譜圖，又稱質(zhì)量碎片圖。這種檢測方式在進(jìn)行痕量物質(zhì)分析時，更能顯示出它們的優(yōu)點(diǎn)。首先靈敏度高，其檢測限可達(dá)5×10-14 g，比全掃描檢測方式提高2～3個置級。第二個優(yōu)點(diǎn)是可對氣相色譜不能分離（即臺峰）的組分進(jìn)行定量測定，這是任何檢測器無法比擬的。在Gaussview 5.0.9中導(dǎo)入模擬好的x.mol格式的分子，在Calculate界面中選用DFT方法和6-31+G基組下計算數(shù)據(jù)，并將計算后的結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin 6.0中，處理數(shù)據(jù)，可以做出SFN的質(zhì)譜圖，如圖2所示。

SFN的特征峰如圖2a下：在質(zhì)荷比m/z為25處的峰離子強(qiáng)度最大，所以在此處的峰為基峰，在質(zhì)荷比m/z為239處的峰為分子離子峰，在此處的峰的質(zhì)荷比比較接近分子的相對分子質(zhì)量。在質(zhì)荷比m/z為85和86出的為苯基的碎片離子峰，在質(zhì)荷比m/z為118左右的系列峰為雜環(huán)斷裂的碎片離子峰。在Gaussview 5.0.9中導(dǎo)入模擬好的mol格式的分子，在Calculate界面中選用DFT方法和6-31+G基組下計算數(shù)據(jù)，并將計算后的結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin 6.0中，處理數(shù)據(jù)，做出取代基F的苯妥英衍生物，如圖2b所示。用-F取代的SFN的衍生物的特征峰如下：在質(zhì)荷比m/z為25處時的峰為基峰，此處的峰的離子強(qiáng)度最大，在質(zhì)荷比m/z為230出的峰為分子離子峰，此處的峰的質(zhì)荷比比較接近分子的相對分子質(zhì)量。在質(zhì)荷比m/z為84的峰為苯基的碎片離子峰，在質(zhì)荷比m/z為118左右的一系列峰為雜環(huán)斷裂碎片離子峰。

3 ?結(jié) 論

目前，有許多文獻(xiàn)對蘿卜硫素的制備及純化，提取物分子離子質(zhì)譜與沸點(diǎn)的關(guān)系等方面的研究前景做了深入的探討。質(zhì)譜及其相關(guān)技術(shù)發(fā)展較晚，相關(guān)市場在臨床質(zhì)譜檢測應(yīng)用方面僅有10年左右，類似基因測序的早期發(fā)展階段。但是憑借其快速、準(zhǔn)確、高通量的優(yōu)勢，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅猛，并且獲得了多個諾貝爾獎項(xiàng)。近年來國際上相關(guān)公司加大了質(zhì)譜技術(shù)研發(fā)力度，質(zhì)譜技術(shù)專利申請數(shù)呈增長趨勢，且多家知名公司于2018年推出數(shù)個新型質(zhì)譜儀及其應(yīng)用方案。相較于國外，國內(nèi)質(zhì)譜技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用還不夠普及。近年來，質(zhì)譜產(chǎn)業(yè)政策利好，市場政策趨于成熟，國內(nèi)市場有很大的發(fā)展空間。李臻等針對蘿卜硫素對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，觀察到蘿卜硫素（SF）對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)表達(dá)的影響， 探討SF對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。通過高斯軟件構(gòu)建了SFN和它的17 種衍生物模型，優(yōu)化結(jié)構(gòu)，運(yùn)用密度泛函活性理論（DFRT）和信息理論指數(shù)（IT），通過計算羰基5位氧原子電荷和9種信息指數(shù)，預(yù)測了蘿卜硫素及其類似分子的沸點(diǎn)值，建立了統(tǒng)一數(shù)值模型預(yù)測羧酸類、羥基類、胺類藥物和類似分子的沸點(diǎn)值，并與用信息指數(shù)建立的預(yù)測方法進(jìn)行了比較，得出以下2點(diǎn)結(jié)論：

1）利用DFT的方法在B3YLYP/6-31+G水平下優(yōu)化蘿卜硫素及其衍生物的結(jié)構(gòu)，并計算了SFN及其衍生物的羰基氧5-O的ESP電荷，NBO電荷和HIR電荷和Mulliken電荷，通過計算得到相關(guān)性最好的關(guān)于預(yù)測沸點(diǎn)的線性方程（y=1 028.24+1 080.58x）， 其中羰基氧5-O-NBO的電荷值與沸點(diǎn)的線性方程的R較大（R2=0.951）;羰基氧5-O原子的GBP熵SGBP值與沸點(diǎn)的線性相關(guān)系數(shù)最佳（y=25.13+1.60x，R2=0.980），即相關(guān)性最高，因此我們可以用此方程來預(yù)測SFN衍生物的沸點(diǎn)。這一方法對SFN藥物的結(jié)構(gòu)研究和物化性質(zhì)和開發(fā)有著重要意義。

2）以外沿電子流去轟擊或其他的作用方式使被測量的樣品失掉外層電子分子正離子化，形成各種質(zhì)荷比（m/z）不同的正離子，然后利用分子電磁學(xué)原理與方法使正離子按不同的質(zhì)荷比值發(fā)生分離并測量各種正離子的強(qiáng)度值，從而能夠確定被測物質(zhì)藥品的分子質(zhì)量和結(jié)分子結(jié)構(gòu)。

本文對SFN及其F-SFN衍生物質(zhì)譜進(jìn)行模擬預(yù)測和描述，其出峰值強(qiáng)度大而靈敏，并指認(rèn)了譜圖中的特征峰。這對我院材料工程與制藥專業(yè)學(xué)生今后學(xué)習(xí)SFN衍生物檢測提供參考數(shù)據(jù)。

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