劉文靜 畢建云 孫玉

摘 ? ? ?要： 優(yōu)選了逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的醇提工藝。以桃仁中苦杏仁苷得率及干膏得率作為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)選出逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的醇提工藝。優(yōu)選出的醇提工藝為：首先將生藥浸泡1 h，后加入4倍藥材量乙醇（70%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）（第二次同樣加入4倍藥材量乙醇（70%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）），以1.5 h作為每次的回流時(shí)間，進(jìn)行2次回流提取，此時(shí)苦杏仁苷得率和干膏得率均優(yōu)于其他提取條件。該工藝穩(wěn)定可靠，省時(shí)節(jié)能，可以用作大規(guī)模生產(chǎn)。

關(guān) ?鍵 ?詞： 正交試驗(yàn);逐瘀止痛;遠(yuǎn)紅外灸貼;醇提工藝

中圖分類號(hào)：TQ 016.1 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）08-1622-04

Abstract：To optimize the alcohol extraction process of blood stasis and pain relieving far-infrared moxibustion sticker， taking the yield of amygdalin and the yield of dry paste in peach kernel as the indicators， based on the single factor experiment， the orthogonal design was used to optimize the alcohol extraction process. The preferred alcohol extraction process was determined as follows： the immersion time 1 h， 70% ethanol use amount 4 times of the quantity of medicinal materials （the second 70% ethanol use amount also was 4 times）， each reflux extraction time 2 h ，and reflux extraction times 2 times. The process is stable and reliable， saves time and energy， and can be used in large scale production.

Key words：Orthogonal test; Pain relieving; Far-infrared moxibustion sticker; Alcohol extraction process

原發(fā)性痛經(jīng)是一種婦科常見(jiàn)病。 常伴隨腰酸腿痛、四肢無(wú)力、頭暈惡心等癥狀。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：原發(fā)性痛經(jīng)之病機(jī)在于“不通則痛”、“不榮則痛”虛實(shí)兩端。中藥活血化瘀藥在改善疼痛的同時(shí)也改善了血液流變性， 可用于長(zhǎng)期治療，優(yōu)勢(shì)明顯，前景廣闊。逐瘀止痛灸貼方來(lái)自于血府逐瘀湯一方，由桃仁，當(dāng)歸、紅花，赤芍等十一味中藥組成。作為活血化瘀之要藥，生桃仁及其醇提物可改善血液流變學(xué)。牛膝具有逐瘀通經(jīng)的功效， 可有效治療閉經(jīng)、痛經(jīng)等病癥。生地黃善于逐血痹， 涼血活血， 養(yǎng)陰益津， 強(qiáng)健體質(zhì)[1-2]。筆者選擇桃仁中中苦杏仁苷的得率及干膏得率為指標(biāo)， 優(yōu)選出乙醇提取桃仁、生地黃、牛膝這三味藥材的工藝條件。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀;GFL-230型恒溫干燥箱;PL-S20型數(shù)碼超聲波提取器;FA2004B電子分析天平;多功能粉碎機(jī)。

1.2 ?藥材與試劑

所用藥材桃仁、牛膝、生地黃均購(gòu)于山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心戰(zhàn)旗副教授鑒定，均符合2015版藥典規(guī)定。硅藻土（批號(hào)：20180110）;苦杏仁苷（批號(hào)：MUST-17022809）;石油醚（批號(hào)：20190305）;甲醇（批號(hào)：20131224），水為純凈水。

2 ?醇提工藝研究

桃仁、生地黃、牛膝采用乙醇提取，正交試驗(yàn)優(yōu)選其醇提工藝，且將桃仁中苦杏仁苷得率和干膏得率作為考察指標(biāo)。

2.1 ?苦杏仁苷的含量測(cè)定[3-7]

2.1.1 ?色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm， 5μm）;流動(dòng)相：甲醇-水（20∶80）;檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm;進(jìn)樣量：10μL;柱溫：30 ℃;流速：1 mL·min-1。

2.1.2 ?苦杏仁苷樣品溶液的制備

1）首先對(duì)桃仁進(jìn)行脫脂：精確稱量桃仁12 g，加100 mL石油醚完全沒(méi)過(guò)藥材，之后使溫度維持在95 ℃進(jìn)行加熱回流1 h，冷卻后濾過(guò)。棄去濾液，揮干石油醚后的藥渣和濾紙備用。

2）按照處方比例精密稱取桃仁（已脫脂）12 g、生地黃9 g、牛膝9 g的醇提藥材共30 g，加6倍量70%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，放冷，濾過(guò)，合并續(xù)濾液，于500 mL容量瓶中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%乙醇稀釋至刻度。精密量取25 mL，蒸至小體積，加入2.5 g硅藻土拌勻，干燥，研細(xì)，置于錐形瓶?jī)?nèi)，精密量取50 mL甲醇，與錐形瓶?jī)?nèi)物質(zhì)混合，進(jìn)而超聲振蕩處理（功率120 W，頻率40 000 Hz）20 min，過(guò)濾，舍棄初濾液，保留續(xù)濾液并用0.45 μm濾膜對(duì)其濾過(guò)，即得。

2.1.3 ?苦杏仁苷對(duì)照液的制備

精確稱量苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品，用70%甲醇溶液制得濃度為0.275 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.4 ?缺桃仁陰性對(duì)照液的制備

按處方比例稱取生地黃和牛膝各9 g，按照2.1.2所示方法，制得缺桃仁陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 ?線性關(guān)系考察

將2.1.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液依次取0.5、1、2、4、6、8、10、15 μL進(jìn)樣，在2.1.1的條件下測(cè)其對(duì)應(yīng)的峰面積積分值，結(jié)合進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)苦杏仁苷進(jìn)行線性關(guān)系的考察。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得：苦杏仁苷在0.137 5～4.125 0 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。計(jì)算得苦杏仁苷的回歸方程為Y=1 114.43X+122.04 ，相關(guān)系數(shù)r=0.999。結(jié)果見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

2.1.6 ?空白干擾實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品液、供試品液、缺桃仁的陰性對(duì)照液各10μL，在2.1.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示相同的保留時(shí)間下，對(duì)照品液與供試品液均有較好的色譜峰， 缺桃仁陰性對(duì)照液在相應(yīng)的位置無(wú)峰。說(shuō)明該測(cè)定方法的專屬性好。見(jiàn)圖2。

2.1.7 ?精密度試驗(yàn)

按照每針10μL的標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)取2.1.2項(xiàng)下的供試品溶液，進(jìn)樣6針，峰面積積分值RSD為1.646%。表明該方法下儀器精密度良好。

2.1.8 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照每針10μL的標(biāo)準(zhǔn)，精密吸取2.1.2項(xiàng)下的供試品溶液，在0、2、4、6、8、24 h各進(jìn)樣一次，在2.1.1色譜條件下，檢測(cè)對(duì)應(yīng)時(shí)刻峰面積積分分值，得RSD為1.548%，這表明24 h內(nèi)苦杏仁苷不產(chǎn)生明顯變化，判為穩(wěn)定。

2.1.9 ?重復(fù)性試驗(yàn)

平行精密量取2.1.2項(xiàng)下的提取液6份，各25 mL，遵循上述方法制備供試液并測(cè)定苦杏仁苷的含量，RSD值為1.35%。表明利用此方法可行，重復(fù)性良好。

2.1.10 ?加樣回收率試驗(yàn)

平行精密移取已知苦杏仁苷含量的供試品液6份，各12.5 mL，分別加入苦杏仁苷對(duì)照品液13 mg，混合至均勻，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試液，并按照含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定苦杏仁苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 ?正交試驗(yàn)優(yōu)選醇提工藝路線

2.2.1 ?粉碎粒度考察

藥材粉碎粒度與有效成分溶出率之間有著密切聯(lián)系。按照處方比例分別稱取不粉碎藥材飲片、過(guò)10目（1 700 μm）、20目（830 μm）篩的桃仁（預(yù)先用石油醚脫脂）12 g、生地黃9 g、牛膝9 g，加6倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，按照2.1.2的方法，測(cè)定苦杏仁苷得率。結(jié)果過(guò)20目（830μm）篩的藥材顆粒中苦杏仁苷的得率最高（22.73>17.94> 13.33 mg·g-1）。因此，選擇粉碎后過(guò)20目（830μm）篩的藥材。

2.2.2 ?醇濃度考察

按照處方比例稱取過(guò)20目（830μm）篩的桃仁（預(yù)先用石油醚脫脂）12 g、生地黃9 g、牛膝9 g，按照6倍藥材量進(jìn)行量取乙醇，分別加入60%、70%、80%三種規(guī)格的乙醇進(jìn)行回流，每次1 h，提取2次。遵循2.1.2的方法，繼而獲得苦杏仁苷得率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷得率在70%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下為最高（22.73> 21.43>21.19 mg·g-1），從而確定提取醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.3 ?因素與水平

在粉碎粒度、醇濃度單因素考察的基礎(chǔ)上，考查加醇量、提取時(shí)間、回流次數(shù)三個(gè)因素，且每個(gè)因素各取3個(gè)水平，選用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，因素水平設(shè)置見(jiàn)表3。

2.2.4 ?試驗(yàn)安排及結(jié)果

按處方比例稱取桃仁（預(yù)先使用石油醚脫脂）12、生地9、牛膝9的醇提藥材過(guò)20目（830μm）篩共計(jì)30，預(yù)先用相應(yīng)量的70%乙醇浸泡1 h， 按照正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)。將苦杏仁苷得率與干膏得率兩者在直觀分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

直觀分析發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間1.5 h與2 h提取的苦杏仁苷的得率相近，從干膏得率可以看出1.5 h要遠(yuǎn)大于2 h，所以選擇1.5 h;提取次數(shù)，提取2次苦杏仁苷的得率與3次相近，干膏得率兩者也相近且遠(yuǎn)大于提取1次，所以選擇提取2次;加醇量4倍的苦杏仁苷的得率與8倍的得率相近，干膏得率4倍量的遠(yuǎn)大于6倍量與8倍量，從省時(shí)節(jié)能的角度看出選擇加4倍量乙醇（70%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。從方差分析可以看出，對(duì)于苦杏仁苷得率的影響程度依次為C>A>B，即回流次數(shù)>加醇量>提取時(shí)間，以省時(shí)節(jié)能為角度，確定最佳提取工藝為A3B2C2。即加入4倍量乙醇（70%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）（第二次同樣加入4倍量乙醇（70%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）），回流提取2次，每次1.5 h。

2.3 ?醇提工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)

按上述優(yōu)化的條件，平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，苦杏仁苷的得率分別為22.07、21.77、22.24 mg·g-1，平均值為22.03 mg·g-1，RSD值為1.09 %。苦杏仁苷的干膏得率依次為45.07%、45.41%、45.32% ，得平均值為45.27%，RSD為0.38%。表明工藝穩(wěn)定可行，可進(jìn)行中試驗(yàn)證。

3 ?討論

苦杏仁苷是桃仁所含苷類中的主要有效成分，桃仁作為君藥，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需精密稱定，因含有大量油脂，故預(yù)先使用石油醚脫脂。梓醇是地黃環(huán)烯醚萜苷中的主要成分之一，也是地黃的指標(biāo)成分[8]。筆者曾試圖也將梓醇作為醇提藥材HPLC圖的指標(biāo)成分，但并未得到理想結(jié)果。牛膝主要含甾酮類、皂苷類及多糖類化合物 [9]。三種藥材采用醇提法，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，操作簡(jiǎn)便，無(wú)污染。單因素實(shí)驗(yàn)考察醇濃度對(duì)于苦杏仁苷得率的影響時(shí)，在60%～70%范圍內(nèi)，苦杏仁苷得率與醇濃度成正比，這可能是因其含有大量的酚羥基，根據(jù)相似相溶的原理，溶解度變大[10]。在70%～80%范圍內(nèi)，苦杏仁苷得率與醇濃度呈反比趨勢(shì)，初步猜測(cè)為乙醇濃度變高的同時(shí)，桃仁中一些醇溶性雜質(zhì)或強(qiáng)親脂性成分的溶出量也在增加，從而降低了苦杏仁苷的得率[11]。

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