王增利， 張 哲， 李鵬坤， 霍惠玲， 李 娥， 甄 理， 董維亞， 化金津， 馮亞文， 仇國明

（1.河北省動物疫病預(yù)防控制中心 050035；2.河北省動物衛(wèi)生監(jiān)督所 050000；3.天津保信立德生物科技有限公司300000；4.河北省獸藥監(jiān)察所 050035；5.天津豪威生物科技有限公司 300000；6.河北省農(nóng)業(yè)招商中心 050000）

禽流感(avian influenza， AI)是由A 型流感病毒引起的一種禽類的急性、烈性、接觸性呼吸道傳染病[1]。 禽流感不僅可以感染禽類，也可以跨宿主感染人類及其他的哺乳動物，因此對禽流感的防控具有公共衛(wèi)生學(xué)意義[4-5]。

禽流感根據(jù)AIV 血凝素(hemagglutinin， HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase， NA) 的不同可分為16 個(gè)HA 亞型，9 個(gè)NA 亞型[2，6]，目前H5 和H9 亞型是我國養(yǎng)禽場主要禽流感，對養(yǎng)禽業(yè)的威脅嚴(yán)重。

疫苗接種是防控禽流感的主要方法。 目前我國使用的是雞胚培養(yǎng)制作的油乳劑滅活疫苗， 在防控禽流感的實(shí)踐中發(fā)揮了重要作用[7-8]。 但該類疫苗也存在著雞胚質(zhì)量控制難度大、工藝復(fù)雜、產(chǎn)生廢物較多、總體生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)，人們開始積極探索新型禽流感疫苗，在類顆粒病毒（VLP)和病毒載體疫苗禽流感疫苗的研發(fā)方面取得了一定的進(jìn)展[4，8]。 國外多位學(xué)者用腺病毒載體攜帶H5N1 完整HA 基因的重組腺病毒免疫小鼠和SPF 雞都獲得良好的保護(hù)[9-11]；國內(nèi)學(xué)者成功地構(gòu)建了共表達(dá)H5N1 亞型禽流感病毒膜蛋白基因M 和HA 的重組腺病毒[12]和共表達(dá)H5N1 禽流感病毒HA 和NA 基因重組腺病毒載體[5]，都為新型禽流感疫苗的研發(fā)提供了更多的技術(shù)路線和方案。 國內(nèi)外研究的結(jié)果顯示，以禽流感血凝素抗原HA 為主要保護(hù)性抗原基因構(gòu)建重組的腺病毒禽流感疫苗具有良好的免疫效果和應(yīng)用前景。

為經(jīng)濟(jì)有效防控養(yǎng)禽場流行的H5N1 和H9N2 兩個(gè)禽流感病毒亞型，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了含有H5N1HA 和H9N2HA 融合基因表達(dá)的重組腺病毒，并經(jīng)過鑒定H5N1HA 和H9N2HA 在同一個(gè)重組腺病毒中得到了良好表達(dá)，用重組腺病毒Ad-H5H9HA免疫SPF 雞，誘導(dǎo)了特異性免疫反應(yīng)，H5N1HA 抗體和H9N2HA抗體都達(dá)到了國家免疫標(biāo)準(zhǔn)， 提示該重組腺病毒Ad-H5H9HA可以作為同時(shí)預(yù)防H5N1 和H9N2 的二價(jià)苗使用，為日后禽流感的防控提供候選疫苗。

1 材料

1.1 細(xì)胞及菌株

人胚胎腎細(xì)胞（HEK293T，美國ATCC 公司）；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 購自北京所萊寶生物公司；TOP10 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 工具酶及主要試劑

AdMax 腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pDC315 和腺病毒系統(tǒng)的基因組質(zhì)粒購自Microbix Biosystems 公司； 質(zhì)粒中提試劑盒QIAGEN midiprep Kit 和膠純化試劑盒， 質(zhì)粒小提試劑盒miniprep kit 均購自QIAGEN 公司； 限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶等購自NewBiolab；Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen； 含有綠色熒光蛋白GFP 基因的重組腺病毒rAd-GFP由天津保信立德生物科技公司提供； 實(shí)驗(yàn)所用儀器設(shè)備及分析純試劑由河北省動物疾病預(yù)防控制中心提供。 引物合成和基因測序工作委托上海生工（用不用全稱）完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物為21 日齡的SPF 雞，由保定瑞普提供；動物免疫和抗體檢測在保定瑞普完成。

2 方法

2.1 H5N1HA 和H9N2HA 融合基因質(zhì)粒的克隆

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查（數(shù)據(jù)待發(fā)表）并結(jié)合國家權(quán)威機(jī)構(gòu)的研究結(jié)果，確定了H5N1 和H9N2 的優(yōu)勢毒株及基因序列，據(jù)此合成了H5N1 和H9N2 的保護(hù)性抗原基HA 的融合基因H5N1HAH9N2HA（簡寫為H5H9HA），然后將融合基因H5H9HA克隆到pUC57 載體中。 克隆策略的設(shè)計(jì)是將H5N1HA 的基因中的終止密碼子及后續(xù)序列去除后，緊接H9N2HA 的起始密碼子，直至H9N2HA 的終止密碼子，使H5N1HA 和H9N2HA 基因成為一個(gè)融合基因（H5H9HA），并且對H9N2HA 的個(gè)別位點(diǎn)做了點(diǎn)突變； 在H5N1HA 啟動子之前加上kozak 序列GCCACC 并在該序列之前增加了EcoRI 酶切位點(diǎn)； 在H9N2HA 終止子后邊增加了NheI 和HindIII 兩個(gè)酶切位點(diǎn)。用GeneArt 無縫克隆和組裝試劑盒將融合基因克隆到載體pUC57 中， 形成帶有目的融合基因H5H9HA 的質(zhì)粒pUC57-H5H9HA。

2.2 帶有目的融合基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5H9HA 的構(gòu)建

首先用EcoRI 酶切載體質(zhì)粒pDC315 和帶有目的基因的質(zhì)粒pUC57-H5H9HA， 分別得到大小3.9kb 和6.1kb 的線性化質(zhì)粒。 用乙醇沉淀經(jīng)EcoRI 酶切處理的pDC315 和pUC57-H5H9HA 片段， 去除酶切反應(yīng)的Buffer 后， 再用第二個(gè)酶NheI做酶切。 將經(jīng)過雙酶切后的載體片段pDC315（EcoRI/NheI）和從pUC57-H5H9HA 中得到的H5H9HA 融合基因（EcoRI/NheI）片段（3415bp）膠回收，回收后分別取1μL，用1%的瓊脂糖膠作一個(gè)量化分析（見圖2），以確定連接反應(yīng)的反應(yīng)體系。 而后進(jìn)行連接反應(yīng)。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5ɑ 后，從過夜培養(yǎng)的平板上挑取單克隆，小提質(zhì)粒，用NheI/XmaI 一次雙酶切鑒定出陽性克隆，經(jīng)過測序進(jìn)一步確認(rèn)目的基因H5H9HA 融合基因是否成功克隆入腺病毒穿梭載體pDC315 中，即是否成功的構(gòu)建了腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5H9HA。

2.3 重組腺病毒載體的包裝和擴(kuò)繁

運(yùn)用AdMax 腺病毒包裝體系，將1.2 項(xiàng)中制備的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5H9HA 與輔助包裝質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1，3Cre 通 過LipofectamineTM 2000 共 轉(zhuǎn) 染 至HEK293T 細(xì) 胞中：用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度為50%～60%，轉(zhuǎn)染前2h 將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清OMEM 培養(yǎng)基， 向一無菌離心管中加入所制備的DNA 溶液（穿梭質(zhì)粒5μg 和輔助質(zhì)粒5μg）與OMEM 混合均勻，調(diào)整總體積為50μL，在室溫下溫育5min，取10uL Lipofectamine 2000 試劑在另一管中與50μL OMEM 混合， 在室溫下溫育5min并將其與DNA 稀釋液進(jìn)行混合，混合后，在室溫下溫育20min，以便形成DNA 與Lipo- fectamine 2000 稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將DNA 與Lipofectamine 2000 混合液轉(zhuǎn)移至HEK293 細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)6～8h 后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基， 每瓶細(xì)胞加入2mL 的PBS 液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物， 然后倒去并補(bǔ)入含1%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 利用Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)的作用實(shí)現(xiàn)重組， 產(chǎn)生重組腺病毒的細(xì)胞中會出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，且有50%細(xì)胞脫壁時(shí)收集毒液。離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用PBS 重懸，凍融4 次，上清即為Ad-H5H9HA 病毒原液。 按1∶10 的比例感染新的293 細(xì)胞，如此反復(fù)制備出四代重組腺病毒。

2.4 重組腺病毒Ad-H5H9HA 的PCR 鑒定及擴(kuò)增純化

對2.3 收集到的病毒液進(jìn)行PCR 鑒定。 將100μg/mL 的蛋白酶K 加入到病毒液中，煮沸5min，以此為模板。 以融合基因H5H9HA 的上游引物5’-gaattcctggatccgccaccatgga-3’，下游引物5’-ttatatacaaatgttgcatctgca-3’； 以H5HA 的上游引物5’-gaattcctggatccgccaccatgga-3’，下游引物5’-aatgcaaattctgcattgtaacg-3’做PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 挑取PCR 鑒定正確的病毒株進(jìn)行擴(kuò)增純化進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 在HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行腺病毒擴(kuò)增并按Adeno-XTMVirus Purification Kit 的步驟純化重組腺病毒。

2.5 以編碼H5N1H9N2 HA 融合基因的重組腺病毒疫苗免疫動物的抗體表達(dá)

將健康狀況良好的21 日齡SPF 雞，按照每組10 只分成四組。將重組rAd-H5H9HA 病毒和禽流感二價(jià)滅活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)、rAd-GFP 分組免疫， 以293 細(xì)胞裂解物免疫作為空白對照。 免疫當(dāng)天采血檢測抗體，分別在免疫后第7、14、21、28d采血和收集血清，采用常規(guī)的血凝抑制方法檢測抗體效價(jià)。

3 結(jié)果

3.1 H5N1HA 和 H9N2HA 融 合 基 因 質(zhì) 粒 pUC57 -H5H9HA 的鑒定

用EcoRI/NheI 酶切鑒定得到的pUC57-H5H9HA 質(zhì)粒，可以看到大小為3415bp 的融合基因片段和大小為2644bp 的載體片段（見圖1），表明融合基因H5H9HA 成功的克隆到pUC57 載體中。

3.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5H9HA 的構(gòu)建

小提連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的單菌落， 用NheI/XmaI 一次雙酶切再次鑒定確認(rèn)， 出現(xiàn)5949bp 和1367bp 兩個(gè)片段的克隆為陽性克隆，在挑選的菌落中得到了陽性克?。ㄒ妶D3），對酶切鑒定陽性的克隆進(jìn)一步基因測序驗(yàn)證， 證實(shí)了成功地構(gòu)建了腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5H9HA。

3.3 重組腺病毒Ad-H5H9HA 的產(chǎn)生和PCR 鑒定

腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5H9HA 與輔助包裝質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1，3Cre，利用Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)的作用在293 細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)重組。 產(chǎn)生重組腺病毒的293 細(xì)胞在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)5～7d 出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE)（見圖4）。通過對收獲的重組病毒樣品的PCR 鑒定，用H5N1HA 基因上游與H9N2HA 基因下游引物擴(kuò)增出3404bp PCR 條帶的為陽性重組腺病毒，用H5N1HA 基因上游與下游引物擴(kuò)增出了1721bp 的片段 （見圖5）。 證實(shí)在重組腺病毒Ad-H5H9HA 中， 既有H5N1HA 基因序列，同時(shí)也有融合基因H5H9HA 的序列。而進(jìn)一步的基因測序結(jié)果也證明了重組腺病毒Ad-H5H9HA 中的融合基因序列與設(shè)計(jì)的H5N1HA 和H9N2HA 的融合基因H5H9HA 的基因序列完全吻合。

3.4 重組腺病毒疫苗免疫動物的抗體表達(dá)

結(jié)果表明， 攜帶H5N1H9N2 HA 基因的腺病毒和禽流感滅活疫苗免疫組雞都產(chǎn)生特異性抗體。 用H5 亞型抗原檢測HI 抗體，rAd-H5H9HA、 禽流感二價(jià)滅活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)H5 亞型抗體產(chǎn)生，在第21d 重組病毒免疫組雞抗體水平達(dá)到峰值，抗體水平均超過免疫標(biāo)準(zhǔn)(6.0)。 rAd-H5H9HA 和禽流感二價(jià)滅活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)產(chǎn)生的抗體水平基本相當(dāng)（見表1）。 同樣，用H9N2 亞型抗原檢測免疫效果，得出的結(jié)果是，rAd-H5H9HA 免疫組在21 d 就產(chǎn)生了高水平特異抗體， 與陽性對照組禽流感二價(jià)滅活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2) 免疫產(chǎn)生的抗體（在相同時(shí)間點(diǎn)）水平相當(dāng)（見表2），與此對應(yīng)的是攜帶GFP 的腺病毒rAd-GFP 和293 胞空白對照組不產(chǎn)生特異性抗體。

圖1 pUC57H5H9HA 酶切鑒定

圖2 pDC315（EcoRI/NheI）和H5H9HA（EcoRI/NheI）連接之前的體系

圖3 腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5H9HA 的雙酶切鑒定

圖4 產(chǎn)生重組腺病毒的293 細(xì)胞出現(xiàn)典型空斑

圖5 重組腺病毒rAdH5H9HA 的PCR 鑒定

表1 重組腺病毒免疫動物后的H5 亞型抗體檢測結(jié)果

表2 重組腺病毒免疫動物后的H9 亞型抗體檢測結(jié)果

4 討論

據(jù)近些年禽流感的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示H5N1 和H9N2兩個(gè)禽流感亞型仍然是對我國養(yǎng)雞業(yè)造成危害最嚴(yán)重的。 從經(jīng)濟(jì)角度及我國的國情出發(fā)，疫苗免疫是禽流感防控的首要措施，目前我國對H5 亞型高致病性禽流感仍采取強(qiáng)制免疫政策，對包括H9 在內(nèi)的其他亞型禽流感提倡疫苗免疫。 現(xiàn)用的H5 強(qiáng)制免疫疫苗是哈獸研利用反向遺傳操作技術(shù)研制的AI 疫苗，目前已經(jīng)有H5 亞型Re-4 株、Re-5 株、Re-6 株、Re-7 株 和Re-8 株疫苗種毒，研制出H5 亞型單苗、二價(jià)苗和三價(jià)苗共10 多個(gè)產(chǎn)品的滅活疫苗，廣泛用于我國多種家禽的H5 亞型A1 免疫預(yù)防。 此外，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)，可同時(shí)預(yù)防H5和H9 亞型AIV 的禽流感(H5+H9)二價(jià)滅活疫苗(HSNI Re-1+H9N2 Re- 2 株)于2007 年獲得新獸藥證書并開始應(yīng)用；隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和成熟，用細(xì)胞培養(yǎng)AIV 來生產(chǎn)A1 滅活疫苗越來越受到關(guān)注和認(rèn)可，一系列疫苗產(chǎn)品相繼問世[3]。 在我國控制禽流感疫情中起到了重要的作用。 但由于該類疫苗用雞胚培養(yǎng)來生產(chǎn)病毒抗原工藝上的局限， 雞胚質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)難度較大，生產(chǎn)工程產(chǎn)生的廢棄物數(shù)量巨大，占用生產(chǎn)空間較大導(dǎo)致總體生產(chǎn)成本較高。 相對于此，以細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)為生產(chǎn)工藝的類顆粒疫苗、 病毒載體疫苗等基因工程產(chǎn)品顯示了良好的發(fā)展?jié)摿9-11]。

HA 作為流感病毒表面的主要糖蛋白之一， 在疫苗免疫壓力下，基因突變和基因重組，是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因[6]。尤為重要的是，HA 蛋白是具有免疫原性的結(jié)構(gòu)蛋白， 不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的中和抗體， 而且還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)， 因此，HA 一直被作為基因工程疫苗研究的首選靶基因[9]。 研究表明，基于禽流感HA 基因所研制的腺病毒載體疫苗、類顆粒病毒疫苗（VLP）對同一亞型病毒的攻擊都產(chǎn)生了接近100%的保護(hù)，但對其他亞型病毒的攻擊保護(hù)率較低。 這也是目前我國商品化的禽流感疫苗多數(shù)采用多價(jià)二價(jià)苗、 聯(lián)苗的原因。 因此理想的禽流感疫苗在設(shè)計(jì)時(shí)就應(yīng)充分考慮對不同亞型的保護(hù)性如何。

H5 亞型和H9 亞型禽流感在我國養(yǎng)禽場長期存在，并且呈現(xiàn)混合致病的趨勢，是威脅養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病。 通過臨床的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)合國家權(quán)威機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)，獲得H5 和H9 亞型的優(yōu)勢流行毒株HA 序列。 利用H5 和H9 亞型優(yōu)勢流行毒株HA 基因保護(hù)性抗原基因來構(gòu)建腺病毒載體H5、H9 二價(jià)苗， 將H9N2的HA 和H5N1 的HA 基因頭尾相連融合在一起（為利于基因表達(dá)對個(gè)別位點(diǎn)做點(diǎn)突變），形成一個(gè)完整的融合基因，然后通過腺病毒穿梭質(zhì)粒和腺病毒輔助包裝質(zhì)粒的重組， 在293 細(xì)胞中成功的重組了腺病毒禽流感H5H9 二價(jià)苗即rAdH5H9HA。 重組腺病毒rAdH5H9HA 經(jīng)過特異引物PCR 鑒定和免疫SPF 雞的特異性抗體檢測， 充分證實(shí)了rAdH5H9HA 得以成功構(gòu)建重組，目的保護(hù)性抗原基因在重組病毒中也得以忠實(shí)表達(dá)； 動物試驗(yàn)證實(shí)rAdH5H9HA 免疫動物后， 同時(shí)誘導(dǎo)了特異性H5 亞型HI 抗體和H9 亞型HI 抗體， 并且抗體的水平在同一時(shí)間點(diǎn)與對照的油乳劑滅活二價(jià)苗產(chǎn)生的抗體一致。 綜合試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組腺病毒rAdH5H9HA 作為同時(shí)預(yù)防H5N1 和H9N2 亞型的禽流感的二價(jià)苗具有一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)， 是一類具有研究潛力的禽流感疫苗。 當(dāng)然重組病毒的滴度以及安全性評價(jià)等方面還需做大量工作，這有待今后的研究中予以充實(shí)完善。 由于腺病毒載體本身具有較強(qiáng)的免疫原性，是抗原基因的產(chǎn)品的良好載體，而且腺病毒載體包裝量大， 一個(gè)載體同時(shí)攜帶多個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)多基因的共表達(dá)，這對于多種亞型同時(shí)流行的禽流感疫苗的研究很有意義。