金俊 , 金青哲 , 王興國 ,*, Casimir C. Akoh ,*

1. 引言

二十二碳六烯酸（DHA）是一種22:6 w-3脂肪酸（FA），它擁有獨特的分子結(jié)構(gòu)和多個雙鍵，主要存在于大腦細胞膜中，對神經(jīng)和視網(wǎng)膜組織的發(fā)育至關(guān)重要[1,2]。胎兒、新生兒和兒童在大腦發(fā)育期若缺乏DHA，可能會造成神經(jīng)生理學方面的疾?。ㄈ缯J知障礙、焦慮癥等）和視覺功能的降低[3,4]。對于成年人，DHA在維持認知功能和情緒表現(xiàn)方面也起著重要的作用[5]。

一般，DHA主要來源于富含α-亞麻酸（α-LNA；18:3 w-3）的飲食和魚類、藻類等海洋食品。然而，人體內(nèi)從α-LNA轉(zhuǎn)化為DHA的效率很低，并不能滿足日常所需，尤其是對于孕婦、肝病或楓糖尿病患者[3,6,7]。另一方面，隨著農(nóng)業(yè)改革和食品工業(yè)的發(fā)展，人們?nèi)粘z入的脂肪已經(jīng)從海洋油脂或α-LNA類油脂（如亞麻籽油）轉(zhuǎn)變?yōu)閣-6類油脂（如大豆油、棕櫚液油和玉米油）與飽和脂肪，從而使w-3脂肪酸的攝入降低，進一步導致了母乳中DHA的含量的減少[8,9]。因此，現(xiàn)代食品加入了更多的魚油、藻油和富含DHA的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)（structured lipids, SL）， 以便人們可以直接攝取DHA [10]。研究顯示，攝入外源DHA的孕婦，其母乳中的DHA含量會比素食主義者母乳的DHA含量高好幾倍 [11]。素食主義者母乳中的DHA主要來源于植物油脂中w-3 FA在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化。

根據(jù)油脂來源不同，DHA可分布在甘油三酯（TAG）分子上不同的位點（sn-1,2或3位）。人體攝入DHA后，sn-1,3位特異性胰脂酶會水解TAG，從而生成sn-2單甘酯（MAG）和游離脂肪酸（FFA）[12]。sn-2 MAG可在小腸黏膜上被很好地吸收，進而被用于重新合成TAG或磷脂（PL，腦細胞膜的重要組成部分）[13,14]。相比較而言，從sn-1和sn-3位水解下來的FFA則沒有被針對性地吸收[15]。因此，DHA分布在sn-2位的TAG比DHA隨機分布的TAG更有利于人體的吸收和利用[16]。類似地，sn-2 DHA MAG相比于DHA甘油二酯（DAG）和DHA乙酯也更容易被機體吸收[17,18]。然而，目前關(guān)于DHA膳食或保健品的指南基本局限于對DHA總量的推薦，很少涉及不同DHA位置分布的相關(guān)信息。

基于藥理和營養(yǎng)角度，TAG和PL分子中DHA的位置分布會影響大腦的發(fā)育和功能維持，因此闡明常見油脂中DHA的分布以及富含sn-2 DHA脂質(zhì)飲食的特點很有必要。本文同時介紹了富含sn-2 DHA SL的酶法合成技術(shù)以及相關(guān)的檢測分析方法。

2. 天然油脂和合成脂質(zhì)中的sn-2 DHA

DHA主要來源于海洋魚油和單細胞油脂[19]。sn-2 DHA脂質(zhì)主要以TAG、DAG、MAG的形式存在于魚油和藻油中，也有以PL的形式存在于蝦油和蛋黃脂質(zhì)中（圖1）。

常見油脂中DHA的含量見表1。單細胞藻油（如Schizochytriumsp.油和Crypthecodinium cohnii油）的DHA含量最高，為44.89%～48.20%, 其次為金槍魚油、沙丁魚油、鳳尾魚油和鮭魚油等（9.76%～26.85%）。然而，在這些魚油中，sn-2 DHA的含量要高于藻油中的sn-2 DHA的含量。在魚油的TAG中，44.79%～72.99%的DHA分布在sn-2位上，而在藻油TAG中，31.66%～42.09%的DHA分布在sn-2位上。這可能與如上所述的sn-2 DHA脂質(zhì)消化特性有關(guān)。魚類以藻類為食，通過消化吸收藻油中的DHA脂質(zhì)生成富含sn-2 DHA的MAG或DAG，進而重新合成TAG，從而提高了sn-2 DHA的占比[15]。

蛋黃和蝦油中的脂質(zhì)一般以PL形式存在（圖1），這與常見的魚油和藻油中的脂質(zhì)不同。不同的脂質(zhì)存在形式會影響大腦對DHA的吸收。含有蝦油的飲食可以增加大鼠大腦中DHA PL的含量，而PL正是大腦細胞膜的主要組成部分[32]。

圖1. sn-2 DHA脂質(zhì)的主要分子結(jié)構(gòu)。X：乙醇胺、膽堿、絲氨酸、肌醇等。

在人乳脂（HMF）中也含有少量DHA，約占總FA的0.36%～0.70%，其中52.63%～65.15%的DHA分布在sn-2位上（表1）。然而，DHA的含量從初乳至成熟乳逐漸減少（0.56%～0.70%→0.36%～0.44%），但在sn-2位上的相對含量卻從52.63%～55.71%增至61.39%～65.15%。此外，在分娩雙胞胎或連續(xù)分娩的母親的母乳中，DHA的含量逐漸降低[33,34]。臨床研究顯示，補充了a-LNA但沒有補充DHA的嬰兒在出生后的前6個月無法維持其大腦中正常的DHA濃度[35]。在新生兒體內(nèi)，a-LNA轉(zhuǎn)換為DHA的效率同樣很低。相比于HMF，許多市售嬰幼兒配方奶粉脂肪（IFF）中的DHA和sn-2 DHA（相對含量為27.56%～48.17%）水平均較低（表1）。在11款西班牙產(chǎn)的IFF中，只有一款I(lǐng)FF在sn-2位上含有DHA。一般而言，為維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，嬰兒需從母乳中日均攝取70～80 mg的DHA [34]。因此，為保護嬰兒免受神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的缺陷，產(chǎn)婦的飲食中通常需要補充外源DHA，尤其是sn-2 DHA脂質(zhì)[4]。

3. sn-2 DHA 對大腦的有益功能

3.1. 吸收sn-2 DHA 脂質(zhì)增加大腦中DHA 的積累

脂質(zhì)約占腦組織干基重量的60% [34]。盡管DHA是維持大腦和神經(jīng)功能正常的關(guān)鍵物質(zhì)，但其被機體吸收和利用的程度顯著受到其在甘油骨架上的位置分布的影響。相比于sn-1,2,3位上隨機分布的DHA，分布在sn-2位上的DHA更容易被腸黏膜所吸收[16]。食用富含sn-2 DHA飲食的新生大鼠，其大腦PL [如磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿（PC）]中的DHA含量顯著高于對照組食用牛奶飲食大鼠的大腦PL中的DHA水平（表2）[36]。類似的研究發(fā)現(xiàn)，相比于未酯化的DHA，大鼠大腦可以優(yōu)先利用sn-2溶血磷脂酰膽堿DHA（表2）[37]。此外，已有大規(guī)模試驗表明，在孕期通過食用較多海洋油脂補充DHA是安全的[38]。

3.2. DHA 通過腸-腦軸增強腦功能

情緒障礙是大腦功能缺陷的癥狀之一，目前認為該癥狀與腸道菌群的改變關(guān)系密切[39]。近年來，人們對大腦問題（如腦損傷、認知能力下降、精神分裂癥、中風、焦慮癥、壓力和抑郁癥）和腸道菌群之間的相關(guān)性頗感興趣。人體腸道內(nèi)生活著1000多種微生物菌群，共計約100萬億個微生物[40]。不同的菌群會改變大腦的功能，反之中樞神經(jīng)系統(tǒng)也可能間接影響腸道微生物的組成。這一系列綜合性的雙向信號傳導途徑被定義為腸-腦軸或腦-腸-菌群軸，主要涉及迷走神經(jīng)和腦脊髓傳導通路（圖2）[41,42]。

表2 大腦對sn-2 DHA脂質(zhì)的吸收

前期研究認為，腸道微生物在開發(fā)復雜腦功能障礙的療法中起著重要作用。一般而言，含有DHA的飲食干預會通過改變腸道微生物的組成而對行為和神經(jīng)生理障礙產(chǎn)生有益的影響[43,44]，見表3。

從表3可知，在大鼠試驗中，補充DHA可重新構(gòu)建大鼠的腸道菌群并使之正?；?，主要表現(xiàn)為有益微生物（如乳酸桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌）豐度的增加，同時變形桿菌（微小未裂桿菌）和藍細菌等的豐度減少，從而有助于緩解早期應激、社交孤立或衰老等大腦功能的相關(guān)障礙。此外，García-Ródenas等[49]認為，攝取富含DHA的飲食，可以使腸道的通透性正?；M而減輕心理壓力，但該路徑未表明需要重新構(gòu)建腸道菌群。這種差異表明，腸-腦軸機制包含多種雙向信息通道，其中一些通道尚未被完全探明，因此需要更多的研究來解釋DHA飲食作用于腸道微生物并影響大腦功能的潛在機制。另外，DHA位置分布差異化的飲食（如富含sn-2 DHA脂質(zhì)飲食和DHA隨機分布脂質(zhì)飲食）對腸-腦軸的影響也有待進一步研究。

4. 酶法合成富含sn-2 DHA 的油脂

許多嬰兒、孕婦和哺乳期婦女僅食用DHA前體物質(zhì)或含有有限D(zhuǎn)HA的食物[11]。目前DHA攝入量減少主要與西式飲食的流行密切相關(guān)[50]。因此，開發(fā)低污染和高效的油脂改性技術(shù)勢在必行，如以飽和脂肪與表1中富含DHA的油脂為原料，通過酶法合成富含sn-2 DHA的改性油脂。這些技術(shù)主要包括酸解、酯交換、醇解及其組合反應。

圖2. 腸-腦軸：大腦和腸道菌群之間可能存在的多條雙向信息通路[41,42]。

4.1. 酸解反應

許多制備sn-2 DHA SL的方法是將單細胞油脂[如來自Crypthecodinium cohnii（DHASCO）的DHA單細胞藻油]和FA（如辛酸）混合，進行一步酸解反應。其中，所使用的酶主要是sn-1,3位特異性脂肪酶或?qū)HA具有高活性的酶。

根據(jù)表4所列舉的酸解反應，最優(yōu)條件的料液比為1:3～1:18（油:FFA）、反應溫度為30～55 ℃、載酶量為4%～15%、時間一般為幾十個小時[51–54]。sn-2 DHA的含量受脂肪酶種類的顯著影響[62]。在一些研究中，脂肪酶，如Pseudomonassp. KWI-56對甘油的三個結(jié)合位點無特異性，但對DHA和二十二碳五烯酸卻具有較高活性，因此該脂肪酶可以解離sn-2位上的DHA，從而在一定程度上導致?；D(zhuǎn)移[52]。這種副反應在辛酸和不同脂肪酶存在時尤其容易發(fā)生[63]。開發(fā)更好的脂肪酶是盡可能減少酰基轉(zhuǎn)移發(fā)生最好的方法。此外，從反應產(chǎn)物中提純目標SL一直以來都較為復雜。對于小規(guī)模反應，反應產(chǎn)物中的FFA可以通過堿液中和被去除，TAG則可通過正己烷萃取獲得，然后通過進一步蒸發(fā)溶劑就可以獲得最終產(chǎn)物SL。

表3 腸黏膜吸收的DHA通過腸-腦軸提高大腦功能

另外一條典型的制備sn-2 DHA SL的技術(shù)路徑是，首先水解單細胞油脂或海洋魚油，以獲得DHA，然后再將DHA酯化成TAG（表4）。在這條技術(shù)路徑中，首先在添加有抗氧化劑（如丁基化羥基甲苯）的體系中，通過氫氧化鉀皂化和鹽酸酸化海洋油脂獲得DHA，隨后DHA與其他油脂酯化成目標SL，具體反應條件是料液比為1:5～1:18（油:DHA）、載酶量為10%、反應溫度為60～65 ℃、反應時間為24 h [25,31,55]。對于大規(guī)模試驗或工業(yè)生產(chǎn)，多余的FFA可通過短程蒸餾法除去。

4.2. 酯交換反應

將富含DHA的油脂或DHA乙酯與FA乙酯進行酯交換是制備SL的另一條技術(shù)路徑（表4）。由于這類反應涉及反應位置的特異性和DHA的空間位阻，因此對酶的種類的篩選比較嚴格[52]。例如，在兩步法反應中，將DHA乙酯和三辛酸甘油三酯以Alcaligenessp.脂肪酶作為催化劑進行非選擇性反應（50 ℃，90 h）來制取DHA隨機分布的油脂，隨后利用Novozym 435脂肪酶作為催化劑進行sn-1,3位特異性酯交換（40 ℃，40 h），制得sn-1,3-二辛酸-2-DHA甘油三酯[56]。該反應在充氮體系中進行，多余的乙酯和三辛酸甘油三酯則通過分子蒸餾法去除。

4.3. 從sn-2 DHA MAG 到sn-2 DHA 甘油三酯

另一條典型的制備富含sn-2 DHA油脂的技術(shù)路徑是，首先從海洋油脂中制取sn-2 DHA MAG，隨后在MAG的sn-1,3位上接上FA（圖3和表4）。

由于DHA易氧化以及酶法催化過程中的?；D(zhuǎn)移和成本等問題，從油脂中制備sn-2 DHA MAG是該技術(shù)路徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[64]。傳統(tǒng)方法是在乙醇體系中采用Novozym 435脂肪酶進行反應，這種酶在乙醇中顯示出sn-1,3位特異性[59,60]。最近有研究報道了一種高效的制備富含sn-2 w-3多不飽和脂肪酸（PUFA）MAG的方法，這種方法以Candida antarctica脂肪酶A作為催化劑，是一種較為經(jīng)濟的方法[65]。在一項同以Candida ant-arctica脂肪酶A為催化劑的研究中，sn-2 DHA含量為20.88%的鳀魚油在低溫（35 ℃）下反應12 h時可被轉(zhuǎn)換為sn-2 DHA含量為65.69%的MAG；與之類似，sn-2 DHA含量為3.24%的藻油在低溫（35 ℃）下反應12 h時可被轉(zhuǎn)換為sn-2 DHA含量為22.20%的MAG [66]。這項研究表明，Candida antarctica脂肪酶A在乙醇體系中表現(xiàn)出無位置特異性且對w-3 PUFA無偏好，因此該脂肪酶可較多地裂解非目標FA，從而將w-3 PUFA（如DHA等）保留在甘油骨架上形成富含DHA的MAG [21,65,66]。

表4 富含sn-2 DHA SL的酶法合成

在純化時，含有DHA的副產(chǎn)物，如FFA和乙酯等，可通過短程蒸餾法和分子蒸餾法回收，以備后續(xù)的重復利用[67]。這條技術(shù)路徑的特點是具備較高的靈活性，并利用sn-2 DHA MAG作為中間體制造不同類型的油脂，如起酥油、人造黃油、涂抹脂、IFF、烘焙油脂和糖果油脂等。

5. sn-2 DHA 的分析技術(shù)

TAG分子中FA的立體異構(gòu)性分析主要是通過安裝有火焰離子檢測器的氣相色譜技術(shù)開展。該方法首先利用sn-1,3位特異性脂肪酶將TAG水解為MAG，然后通過薄層層析法將sn-2 MAG分離出來，并將其甲酯化后進行檢測器檢測[68]。其中，常用的sn-1,3位特異性脂肪酶是胰脂酶。然而，有研究認為胰脂酶并不能充分水解TAG分子上所有的FA，尤其是海洋魚油中的PUFA [57]。胰脂酶水解的程度取決于FA的種類和雙鍵的位置[69]。相比較而言，Candida antarctica脂肪酶B（Novozym 435或Lipozyme 435）則可以較好地水解PUFA [70,71]。盡管在很多情況下Lipozyme 435是一種非特異性脂肪酶，但在過量的乙醇體系中，它會表現(xiàn)出sn-1,3位特異性[70]。有研究分別利用Novozym 435和胰脂酶兩種方法測定了魚油中PUFA的組成，見表5。Novozym 435水解魚油中PUFA的效率根據(jù)碳鏈長度與飽和度的不同而不同。例如，用胰脂酶法測得的二十碳五烯酸（EPA）含量（7.5%～10.8%）高于用Novozym 435法測得的EPA含量（6.8%～9.0%），而DHA的檢測結(jié)果正好相反[71]。這說明Novozym 435相比于胰脂酶可以更好地水解DHA。

總體上，Novozym 435法需要嚴格的水解條件才能完全釋放TAG的sn-1,3位上的FA，如醇油比、反應時間和溫度等，否則，會因水解反應不充分而導致檢測值低于C-13核磁共振（13C NMR）的檢測值或預測值。在一項魚肝油試驗中，由Novozym 435法得到的sn-2 DHA含量為69.4%，該值低于由13C NMR法測得的sn-2 DHA含量（72.5%）；而當研究對象為金槍魚油時，兩者的sn-2 DHA含量的檢測結(jié)果接近，其中Novozym 435法測得的值為53.1%，13C NMR法測得的值為52.0% [72]。

6. 結(jié)論

海洋魚油和藻油是典型的DHA來源油脂，其中約一半的DHA FA結(jié)合在sn-2位上。相比于分布在sn-1,3位上的DHA油脂，sn-2 DHA脂質(zhì)這種獨特的結(jié)構(gòu)可促使DHA更易被腸黏膜所吸收，并被用于體內(nèi)TAG或PL的重新合成。因此，sn-2 DHA脂質(zhì)在大腦功能發(fā)育和緩解焦慮、壓力、認知能力下降、精神分裂癥和中風等腦部疾病方面起到積極的作用。研究腸-腦軸是了解DHA飲食對大腦功能有益影響的最有效策略。該機制認為，通過DHA飲食的干預可以重新構(gòu)建或正?；c道菌群，從而解決與大腦功能相關(guān)的問題。然而，腸-腦軸包含的諸多雙向信息通道尚未被完全研究清楚。今后我們還需要進一步研究sn-2 DHA脂質(zhì)補充對腸道微生物和大腦功能的影響。

圖3. 典型的sn-2 DHA SL制備路徑。

表5 魚油中sn-2 PUFA組成的測定（胰脂酶法和Novozym 435法）[71]

人類在兩歲以前，大腦中的DHA含量積累迅速。雖然HMF中DHA的含量在嬰兒出生15天后已降至較低水平，但sn-2 DHA含量卻呈增長趨勢，這也說明sn-2 DHA在嬰幼兒和兒童大腦發(fā)育中的重要性。因此，我們建議在日常飲食中攝入富含sn-2 DHA的SL。這類SL的制備可首先通過將富含DHA的油脂水解為sn-2 DHA MAG，再在sn-1,3位上結(jié)合所需的FA。在未來的研究中，我們應開發(fā)高sn-1,3位活性或?qū)Ζ?3 PUFA沒有偏好的脂肪酶，從而在溫和的反應條件和純化技術(shù)下提高合成的效率和經(jīng)濟性。

致謝

本文得到了國家留學基金管理委員會資助項目（201706790068）和江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室自由探索資助課題（SKLF-ZZA-201705）的支持。美國喬治亞大學食品科學與技術(shù)系也對該工作提供了部分支持。

Compliance with ethics guidelines

Jun Jin, Qingzhe Jin, Xingguo Wang, and Casimir C.Akoh declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Nomenclature

α-LNA: α-linolenic acid

ARA: arachidonic acid

DAG: diacylglycerol

DHA: docosahexaenoic acid

DPA: docosapentaenoic acid

EPA: eicosapentaenoic acid

FA: fatty acid

FFA: free fatty acid

HMF: human milk fat

IFF: infant formula fat

MAG: monoacylglycerol

NMR: nuclear magnetic resonance

PC: phosphatidylcholine

PUFA: polyunsaturated fatty acid

SL: structured lipid

TAG: triacylglycero