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自體腹膜移植回腸漿肌擴大原位膀胱的重建

2020-09-04 07:06:02宋志強沈海山李春峰阮英卯李勝文
中國醫(yī)學科學院學報 2020年4期
關鍵詞:原位上皮腹膜

沈 俊,宋志強,沈海山,李春峰,阮英卯,李勝文

1貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿外科,貴陽 550004 2清華大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科,北京 100016 3清華大學第一附屬醫(yī)院病理科,北京 100016

腸管是用于膀胱重建的主要組織材料,廣泛應用于臨床上。由于腸黏膜具有分泌和吸收功能,尿液與腸黏膜慢性相互作用,使得腸代膀胱術后仍然存在不同程度諸多并發(fā)癥,比如代謝紊亂、腸黏液增多堵塞尿道及惡性腫瘤形成或復發(fā)等。為探求一種理想的腸代膀胱重建的方法,以減少腸代膀胱術后的并發(fā)癥,本研究采用腹膜取代腸黏膜建立了自體腹膜移植回腸重建膀胱的小型豬實驗模型,并對其進行形態(tài)學、動力學和病理組織學等方面的研究。

材料和方法

材料采用封閉飼養(yǎng)的成年(6~8個月)實驗用小型豬6只,雌性,體重28~33 kg(由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供,購于北京市琉璃河科興實驗動物養(yǎng)殖中心。又名:中華小型豬,北科源實驗用小型豬。產地:北京房山。種系來源:貴州小型豬)。CAT307尿流率膀胱測壓管(Medical Technologies Canada ULC),AQUARIUSXLT尿動力檢查儀(加拿大Laborie公司),PLX5200可移動X光機(南京普朗醫(yī)療設備有限公司),JSM5510掃描電子顯微鏡(日本),TEM1010/JEM1010透射電子顯微鏡(日本)。一抗鈣網膜蛋白、抗波形絲蛋白、CK7和UPK3鼠抗人單克隆抗體,二抗(抗兔和鼠IgG)及S-P試劑盒均為美國Jackson公司產品,購自北京中杉金橋生物技術有限公司。DAB酶底物顯色試劑盒由清華大學第一附屬醫(yī)院病理科提供(購自中國五聯化工廠,上海)。MASSON特染試劑盒:北京阜外醫(yī)院病理科提供。

方法術前準備:術前24 h禁食,10 h禁飲;麻醉后備皮;同時建立耳背靜脈通道,輸液(生理鹽水100 ml+頭孢呋新0.75 g,術前/后各用1次,5%葡萄糖注射液500 ml);手術方法:長段回腸漿肌剝離術(約35 cm)+大面積自體腹膜移植術[約(15×10)cm2]+膀胱次全切除術+原位膀胱擴大重建術;術后12周處死動物之前,采集血、尿樣與術前采樣進行對比分析研究,行尿流動力學及膀胱造影檢查,處死動物后取出膀胱標本進行常規(guī)、分子病理學檢測、MASSON三色特染以及電鏡觀察。

統計學處理兩組間樣本計量資料比較采用配對t檢驗進行統計分析,實驗數據采用Stata- 13.0數據處理軟件進行統計分析,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一般情況6只實驗用小型豬手術順利完成,無一只動物死亡。手術切口未出現明顯感染跡象,觀察飼養(yǎng)期間無需拆線,實驗動物術后均未見腸梗阻、尿瘺、腹膜炎等并發(fā)癥發(fā)生。術后第5天拔除雙側輸尿管導管,第7天拔除氣囊尿管,觀察動物排尿情況,發(fā)現祛除尿管后,動物均出現尿頻,每0.5~1.0小時約1次,3 d后逐漸有所緩解,從肉眼觀察尿液黃清。

尿常規(guī)及尿沉渣測定結果手術后12周測定實驗用小型豬的尿常規(guī)顯示其中的白細胞、尿比重與手術前尿常規(guī)結果比較差異均無統計學意義(P均>0.05)(表1)。直視下穿刺膀胱收集尿液,將之混勻后吸取10 ml置入離心管,通過離心機旋轉沉降分層(3000轉/min,轉子半徑5 cm,離心15 min),棄掉上清液,電子天平稱重,減去離心管的質量得到尿沉渣的質量,再與術前進行對比,結果顯示術前與術后尿沉渣質量差異無統計學意義(P>0.05),術后新膀胱無腸黏液分泌,也無結晶形成。

表1 術前與術后12周動物尿白細胞及尿比重比較

電解質、血清肌酐和尿素氮水平與手術前比較,手術后12周電解質、血清肌酐和尿素氨水平差異均無統計學意義(P均>0.05)(表2)。

表2 術前與術后12周豬電解質、血清肌酐和尿素氮水平比較

手術前后動物膀胱造影經尿管注入200 ml碘海醇生理鹽水稀釋液(1∶1),拔除尿管,經陰道置入F26金屬尿道探子(對比尿道長度),見正常膀胱充盈形態(tài)圓潤光滑,尿道長約12 cm(距恥骨聯合下方,尿道開口于陰道內);術后12周新膀胱充盈形態(tài)稍小,略顯僵硬,頂部靠近前腹壁,可能與腸系膜牽拉有關,未見造影劑滲漏(圖1)。

圖1 手術前(A)與手術后12周(B)豬膀胱造影比較

手術前后動物膀胱壓力容積術前動物膀胱容量平均為(587.17±22.31) ml,術后新膀胱平均容量(369.50±17.56)ml,兩者比較差異有統計學意義(P=0.038),但膀胱順應性卻很接近(術前15.69±2.13比術后14.31±1.35,P=0.7173)(表3)。

表3 手術前與手術后12周豬膀胱壓力容積測定比較

病理顯微組織觀察結果術后12周分別麻醉處死6只動物,切除重建的新膀胱標本送檢,結果顯示HE染色后膀胱腔面表層上皮完整、連續(xù),細胞層次排列有序,5~7層,與正常膀胱移行上皮類似,未見絨毛柱狀上皮細胞及杯狀細胞再生,黏膜下肌層結構清晰,可見新生毛細血管,未見明顯中性粒細胞聚集;免疫組織化學反應顯示未見自體移植腹膜;抗波形絲蛋白陰性表達,鈣網膜蛋白陰性表達;而存活良好漿肌腸段上覆蓋著5~7層膀胱尿路移行上皮細胞;上皮類特異抗體CK7染色強陽性,尿路移行上皮特異性抗體UPK3染色強陽性,上皮與肌層之間未見回腸黏膜上皮細胞與杯狀細胞殘留。MASSON染色顯示平滑肌層結構清晰,腔面表層黏膜細胞呈復層移行上皮細胞,排列有序,連續(xù)性好,無斷裂及錯位,未見柱狀或杯狀細胞,肌層間未見明顯膠原纖維增生(藍綠色淡染),黏膜下可見毛細血管增生較明顯(圖2)。

電鏡超微結構掃描電鏡結果顯示正常膀胱黏膜上皮細胞呈長梭形,邊角圓潤,細胞之間縫隙很小,排列致密(圖3A)。術后12周新膀胱黏膜上皮整體結構完整,橢圓形的黏膜細胞,邊角較圓鈍,細胞個體之間的連接縫隙變小,排列整齊、疏松(圖3B)。透射電鏡觀察顯示,正常回腸平滑肌細胞呈梭形,細胞與細胞之間連接緊密,排列整齊,界限清楚,位于細胞中央的細胞核類似梭形,形態(tài)正常,點狀致密斑清晰可見,基底膜完整,間質內僅見少許纖維細絲(圖3C)。術后12周新膀胱肌纖維細胞的超微結構顯示,平滑肌細胞呈梭形,排列整齊,未見明顯肥大,基底膜和致密斑清晰可見,細胞漿成分無脫落,境界清,線粒體形態(tài)未見異常,無聚集,無腫脹,間質纖維絲無明顯增生(圖3D)。

A.新膀胱黏膜上皮覆蓋完整(箭頭)(HE染色,×40);B.黏膜及黏膜下抗波形絲蛋白陰性表達(免疫組織化學,×100);C.黏膜及黏膜下鈣網膜蛋白陰性表達(免疫組織化學,×100);D.CK7在新膀胱黏膜全層細胞強陽性表達(免疫組織化學,×200);E.UPK3在新膀胱黏膜表層細胞強陽性表達(免疫組織化學,×100);F.MASSON染色,黏膜下有毛細血管增生(箭頭)(免疫組織化學,×40)

A.正常膀胱黏膜掃描電鏡表現;B.術后12周新膀胱黏膜掃描電鏡表現;C.正?;啬c平滑肌細胞透射電鏡表現;D.術后12周新膀胱平滑肌細胞透射電鏡表現

討 論

盡管原位腸代膀胱手術技巧日臻完善,但用來修復重建新膀胱的腸管本質未變,因而手術后與其相關的分泌及吸收所致并發(fā)癥仍然困擾著臨床醫(yī)生與患者,盡管也有許多學者曾經想到破壞腸黏膜的方法,比如:用化學方法(酶/無水乙醇)破壞黏膜,或用機械方法刮除黏膜,以期減少腸黏膜的吸收與分泌,但效果均不盡如人意[1- 3]。相對于傳統方式,本研究采用從腔外完整剝離回腸黏膜及黏膜下層,并用自體腹膜移植覆蓋于回腸漿肌層制作成腹膜-回腸漿肌游離復合瓣修復擴大膀胱的方法,既可祛除術后相關并發(fā)癥,又可保護剝離創(chuàng)面肌層免受尿液侵蝕與刺激,同時,重建新膀胱的形態(tài)及功能與變化差異不大。經同種動物實驗研究顯示,采用異體膀胱黏膜修復膀胱時,術后7周之內,移植黏膜存活良好,8周以后,移植物完全被自體膀胱黏膜替代[4]。同樣,有學者在利用游離腹膜管重建長段黏膜剝脫輸尿管的犬實驗研究中發(fā)現,術后10周該腹膜組織被完整成熟的移行上皮替代[5]。因此,為安全起見,本研究選擇術后12周作為后續(xù)實驗檢測及標本取出時間,病理及電鏡觀察結果顯示術后12周新膀胱內移植腹膜消失(腹膜特異性抗體鈣網膜蛋白和抗波形絲蛋白均陰性表達),被成熟的尿路移行上皮細胞完全爬行替代(尿路上皮特異性抗體UPK3與上皮類特異性抗體CK7均強陽性表達),掃描電鏡也清晰看到表面覆蓋的是幾乎完全成熟的尿路移行上皮細胞。

臨床上,對于原位可控回腸膀胱術后功能檢測方面,不同的手術方式對術后新膀胱儲尿功能的影響也不同。Tanaka等[6]在Studer 原位回腸新膀胱術后3個月~2年分別行尿流動力學檢測顯示,新膀胱容量約為(439±185)ml。Sevin等[7]在W形原位回腸新膀胱術后行尿流動力學檢測顯示,新膀胱容量約為(550±200)ml,最大膀胱壓約為(26.4±15.0)cmH2O。Steven和Poulsen[8]在Kock原位回腸新膀胱術后行尿流動力學檢測顯示,新膀胱的最大膀胱壓和容積相當穩(wěn)定,術后6個月,新膀胱容量約為(456±255)ml,最大膀胱壓約為(47±40)cmH2O;術后5年新膀胱容量約為(411±290)ml,最大膀胱壓約為(50±30)cmH2O。本研究在術前對正常實驗用小型豬進行膀胱壓力容積測定,平均容量為587 ml,最大膀胱壓為34~41 cmH2O,平均為37.5 cmH2O,順應性平均為15.69,這與正常成人測定值相差不大。本研究采用的是半U形與膀胱三角區(qū)和膀胱頸吻合重建原位新膀胱,術后12周進行膀胱壓力容積測定,平均容量為369.5 ml,最大膀胱壓為21~29 cmH2O,平均為25.5 cmH2O,順應性平均為14.31。術后動物膀胱的順應性與術前相比差異無統計學意義(P>0.05),表明術后膀胱功能恢復較好,結合術后早期剛拔除尿管時明顯尿頻(1次/0.5~1 h)到術后12周排尿狀況逐漸恢復,表明膀胱術后功能的恢復需要一個過程,其長短取決于腹膜覆蓋回腸漿肌存活的時間以及被尿路移行上皮取代的快慢。只要覆蓋腹膜存活,其下方肌層會自然舒展,恢復其延展性。本研究顯示MASSON特染無明顯的膠原纖維增生,透射電鏡未觀察到平滑肌細胞結構形態(tài)明顯變化,纖維絲無增生,而且術后12周的膀胱造影顯示新膀胱形態(tài)雖然較正常的膀胱偏小,但是和術中40 ml氣囊的支撐容量相比明顯恢復,尿流動力學檢測結果更進一步證實移植腹膜對回腸平滑肌的保護作用,新膀胱的順應性與正常膀胱相比差異無統計學意義(P>0.05)。這和國外Coleman等[4]與國內鄒建華等[9]的研究結果一致。另外,術后的膀胱容量沒有術前大是否跟術中取材偏少有關?膀胱壓也較術前小,這是否和回腸肌層薄弱有關?這些還需要術后更長時間的觀察比較才能明確。此時可以肯定的是新膀胱無纖維化攣縮變形,表明移植腹膜早期對新膀胱肌層覆蓋保護有效。病理結果顯示,術后12周對于一個擴大重建新膀胱來說,尿路移行細胞可以完全覆蓋整個新膀胱腔面,移植腹膜完全被吸收消失,從而形成了一個具備完整移行上皮的真正代膀胱。根據尿流動力學檢測結果,本研究動物術后的膀胱壓力容積測定值都在其術前測定正常范圍內,不僅可以對原位新膀胱做個參考,還可以為以后深入研究及其對照實驗做好鋪墊。

本研究設計擴大重建原位新膀胱的功能除了能夠貯尿和排尿之外,還體現在能克服原來腸代膀胱所不能解決的與腸黏膜分泌和吸收相關的并發(fā)癥。在臨床上,根據患者滲透壓、腎功能、所截取腸段的部位、腸段長度等決定了水電解質紊亂的嚴重程度和類型[10]。高血氨癥、低鉀、低鈣等多見于回腸代膀胱,在各腸段中又以高氯性酸中毒最多見,常有超過2/3以上的發(fā)生率[11]。代謝性酸中毒在結腸代膀胱的發(fā)生率為10%~15%[12]。而上述這些與吸收相關的電解質代謝紊亂并發(fā)癥在本研究設計重建的新膀胱里未發(fā)現,根據術后12周生化結果顯示與術前正常動物相比,差異無統計學意義(P>0.05),表明新膀胱在祛除回腸黏膜及黏膜下層之后,在腹膜的覆蓋保護下沒有吸收功能;有學者研究顯示腸代膀胱術后腫瘤發(fā)病率接近2%,結腸癌在一般人群中的發(fā)病率較低,在腸代膀胱術后,發(fā)生癌的概率可以提升100~500倍。如果年齡小于25歲經歷尿流改道的患者,癌癥發(fā)生率甚至可高達7000倍[13]。腫瘤具體位置多見于吻合部或鄰近的腸上皮,即移行上皮與腸上皮交界處。對于這些腫瘤的發(fā)生機制,在醫(yī)學界還沒有統一的認識,但多數人普遍認為,腸上皮與尿路移行上皮的吻合是其發(fā)生的前提[14]。因為不管有無尿液刺激,只要二者接觸,同樣會發(fā)生腫瘤;腫瘤的發(fā)病率最高一定是在吻合交界處有糞便和尿液共同接觸時,如果只有糞便或尿液其中一種接觸,腫瘤的發(fā)病率就會明顯降低[15]。泌尿系結石在腸代膀胱術后患者中的發(fā)病率升高,兒童腸膀胱擴大者結石發(fā)病率為40%左右,Kock膀胱結石為20%左右,回腸膀胱結石可高于30%[16]。本研究新膀胱里目前未發(fā)現腫瘤及結石,但這并不能表明以后就一定也沒有,需要1年、2年或更長時間的觀察才能知曉;腸上皮能夠分泌黏液,腸膀胱術后,由于腸道本質未變,大量黏液栓生成,可以引起輸出道梗阻,增加尿路感染的機會。腸代膀胱后,常見無癥狀性菌尿,在70%以上的尿常規(guī)中可發(fā)現較多細菌[17]。腸壁感染、缺血及黏液栓阻塞出口致膀胱過度擴張可使重建后新膀胱發(fā)生自發(fā)破裂[18]。本研究通過尿液的常規(guī)檢查與尿沉渣的沉降分析顯示未發(fā)現與腸黏液分泌有關的異常結果;尿中白細胞和比重與術前相比差異無統計學意義,尿液高速離心后提取尿沉渣稱重與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。上述各種并發(fā)癥的出現都是因為腸代膀胱中腸黏膜和黏膜下層的存在,幾十年來很多專業(yè)學者都在思考和嘗試去解決它們,也找到了很多辦法,但效果都不太令人滿意。本研究采用自體移植術將腹膜直接種植在回腸漿肌上擴大重建原位新膀胱的方法,解決了以往腸代膀胱術后難以克服的與腸黏膜吸收分泌相關的諸多并發(fā)癥,但要把它真正用于臨床還需要更深入的研究比較與更長遠的觀察。

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