郭智寬 田 捧

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一組臨床表現(xiàn)為持續(xù)時(shí)間大于6個(gè)月的體力、腦力疲勞，同時(shí)伴有肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、頭痛及情緒低落、失眠、抑郁等心理精神癥狀的綜合征[1]。在古代中醫(yī)藥著作中尚未發(fā)現(xiàn)慢性疲勞綜合征的病名，根據(jù)CFS的臨床表現(xiàn)，其應(yīng)屬于“虛勞”“郁證”“內(nèi)傷發(fā)熱”等范疇。多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為其病位以肝、脾、腎為主，發(fā)病多因思慮、勞作過度或外邪侵襲致肝、脾、腎受損致使肝失疏泄，脾失運(yùn)化，腎氣不充而導(dǎo)致氣血陰陽虧虛，從而引發(fā)本病。冬蟲夏草性溫味甘；歸腎、肺經(jīng)；具有補(bǔ)腎益肺，止血化痰的功效。發(fā)酵蟲草菌粉膠囊系從青海冬蟲夏草中分離所得的蟲草擬青霉CS-4菌株，經(jīng)純化、人工發(fā)酵培養(yǎng)加工制成的口服制劑。與天然蟲草有著類似的化學(xué)成分和藥理作用。我們前期臨床觀察中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蟲草菌粉膠囊對(duì)CFS患者有比較好的療效[2]。但其對(duì)CFS治療的作用機(jī)理尚不明確，鑒于此，我們?cè)谝酝难芯炕A(chǔ)上，用慢性疲勞大鼠動(dòng)物模型來觀察發(fā)酵蟲草菌粉膠囊對(duì)CFS的治療作用，從而探討其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)成年雄性SD健康大鼠72只，體質(zhì)量(200±20)g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK豫2005-0001)。

1.1.2 動(dòng)物飼料大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK豫2005-0001)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品發(fā)酵蟲草菌粉(金水寶)膠囊由江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司制造，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10890003，規(guī)格：0.33 g/粒；蓯蓉益腎顆粒由內(nèi)蒙古蘭太藥業(yè)有限責(zé)任公司制造，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030099，規(guī)格:2 g/袋。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器促腎上腺皮質(zhì)激素放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；碘[125I]皮質(zhì)醇放射免疫分析藥盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn))；SN-682型放射免疫γ計(jì)數(shù)器(上海核福光電儀器有限公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組正常喂養(yǎng)1周，72只大鼠自然飲食，在室內(nèi)光照，溫度(20±1)℃，相對(duì)濕度40%的環(huán)境中，6只/籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后將SD大鼠72只采用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行隨機(jī)分組，分為正常組、模型組、發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組、蓯蓉益腎顆粒組，每組12只。

1.2.2 造模方法造模之日起，除正常組外，其余大鼠根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3,4]的睡眠剝奪+負(fù)重力竭游泳方法建立復(fù)合因素致慢性疲勞大鼠模型。睡眠剝奪方法：向鼠籠內(nèi)注入1.5 cm深的水，將大鼠放入其中盒蓋上放置飼料和水，使大鼠能夠自由進(jìn)食飲水。每日于13:00將大鼠放入，次日9:00將大鼠取出，睡眠剝奪共20 h；負(fù)重力竭游泳方法：睡眠剝奪后，每日9:00進(jìn)行負(fù)重力竭游泳訓(xùn)練，將負(fù)重其身體質(zhì)量的5%的大鼠放入水深50 cm的游泳池內(nèi)，水溫(25±1)℃，使其游泳至力竭，頭部沒入水中10 s無法浮出水面即判定為力竭狀態(tài)。

1.2.3 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及游泳速度測(cè)試方法采用Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)，規(guī)格：直徑150 cm，高60 cm，內(nèi)設(shè)一低于水面的圓柱形平臺(tái)直徑9 cm，水深以高過平臺(tái)2 cm為度，造模前2 d將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序依次放入水迷宮實(shí)施訓(xùn)練，造模前1天進(jìn)行水迷宮測(cè)試，將大鼠從2個(gè)固定點(diǎn)入水到找到平臺(tái)所需的平均時(shí)間，作為大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)。造模結(jié)束后第1天再次測(cè)試各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)找到平臺(tái)所需的時(shí)間，作為大鼠的記憶成績(jī)。在測(cè)時(shí)間的同時(shí)檢測(cè)大鼠游泳速度。

1.2.4 鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)將大鼠尾端2 cm的部位粘貼在一水平板上(使板離地1 m)，使動(dòng)物呈倒掛狀，計(jì)算6 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。造模前1 d和造模結(jié)束后1 d分別測(cè)試1次。

1.2.5 給藥方法從造模第14天開始，正常組正常飼養(yǎng)，模型組給予生理鹽水灌胃，3 ml/只；蓯蓉益腎顆粒組按417 mg·kg-1·d-1給予蓯蓉益腎顆粒灌胃，3 ml/只；發(fā)酵蟲草菌粉組高、中、低劑量組分別按1238 mg·kg-1·d-1，619 mg·kg-1·d-1，309 mg·kg-1·d-1(藥物劑量按等效劑量的直接折算法計(jì)算，309 mg·kg-1·d-1相當(dāng)于人臨床劑量的等效量)給予發(fā)酵蟲草菌粉混懸液灌胃，3 ml/只。各組大鼠給藥均1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.6 標(biāo)本制作方法

1.2.6.1 檢測(cè)ACTH標(biāo)本的采集及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠后，打開腹腔，從腹主動(dòng)脈取血2 m1收集到加有10%EDTA-2Na30 μl和抑肽酶20 μl的試管中，混勻于離心機(jī)4 ℃、3000 rpm離心10 min，分離血漿放置冰箱冷凍(-20 ℃)中保存待測(cè)ACTH。冰凍樣品測(cè)定前，使樣本置于室溫中復(fù)融，再次4 ℃、3000 rpm離心5 min,取上清測(cè)定。檢測(cè)時(shí)按照試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6.2 檢測(cè)CORT標(biāo)本的采集采血方法同上。檢測(cè)時(shí)按照試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)造模前各組大鼠6 min間斷不動(dòng)時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；造模后，與正常組比較，模型組大鼠6 min不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組6 min不動(dòng)時(shí)間縮短，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組6 min不動(dòng)時(shí)間縮短，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組6 min不動(dòng)時(shí)間縮短，差異有顯著性意義(P<0.05)，發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組6 min不動(dòng)時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組比較，發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組6 min不動(dòng)時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組6 min不動(dòng)時(shí)間縮短，差異有極顯著性意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠造模前后鼠尾懸掛間斷不動(dòng)時(shí)間比較 (只，

2.2 morris水迷宮實(shí)驗(yàn)造模前各組大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；造模后，與正常組比較，模型組大鼠找到水中平臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng)，記憶成績(jī)下降，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組記憶成績(jī)提高，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中劑量組記憶成績(jī)提高，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組記憶成績(jī)提高，差異有顯著性意義(P<0.05)；與發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組記憶成績(jī)提高，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。造模前，各組游泳速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；造模后，與正常組比較，模型組大鼠游泳速度減慢，差異有極顯著意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組游泳均速度增快，差異有極顯著意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、低劑量組速度較快，差異有顯著意義(P<0.05)；發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組大鼠造模前后學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)比較 (只，

表3 各組大鼠造模前后游泳速度比較 (只，

2.3 血漿ACTH含量與正常組比較，模型組大鼠血清ACTH含量明顯升高，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組ACTH含量降低，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中劑量組含量進(jìn)一步降低，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組ACTH含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組ACTH含量降低明顯，差異有極顯著性意義(P<0.01)，而與發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠造模后血漿ACTH含量比較 (只，

2.4 血清CORT含量造模后，與正常組比較，模型組大鼠血漿CORT含量明顯升高，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組CORT含量降低，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組CORT含量降低明顯，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組差異有顯著性意義(P<0.05)，發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組與其相比CORT含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組CORT含量降低明顯，差異有極顯著性意義(P<0.01)，而與發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠造模后血清CORT含量比較 (只，

3 討論

CFS是一種可發(fā)生于成人、青少年、兒童各個(gè)年齡階段的以長(zhǎng)期身心疲勞為主要表現(xiàn)的疾病[5]。隨著現(xiàn)代人們競(jìng)爭(zhēng)壓力逐漸加大，CFS的發(fā)病率呈逐漸升高趨勢(shì)，國(guó)外報(bào)道成人患病率在0.23%～2.60%[6]，中學(xué)生中患病率在0.1%～2%[7]。目前其病因并不明確，其中很多研究認(rèn)為長(zhǎng)期的精神壓力、體力超負(fù)荷等多重應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺素軸異常是其發(fā)生的關(guān)鍵原因之一[8]。而我國(guó)沈自尹院士認(rèn)為中醫(yī)腎虛本質(zhì)為下丘腦-垂體-腎上腺素軸功能紊亂[9]?！端貑枴ち?jié)藏象論》曰：“腎者，作強(qiáng)之官，伎巧出焉。”《靈樞·海論》中說：“髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥”。因此腎虛可以導(dǎo)致腦力、體力疲勞的產(chǎn)生。結(jié)合以上理論，我們認(rèn)為中醫(yī)治療CFS應(yīng)以補(bǔ)腎為主。發(fā)酵蟲草菌粉是從冬蟲夏草中分離所得的蟲草擬青霉CS-4菌株，經(jīng)純化、人工發(fā)酵培養(yǎng)加工制成的口服制劑，與天然蟲草有著類似的化學(xué)成分和藥理作用[10]。其可補(bǔ)益肺腎，秘精益氣，能夠上補(bǔ)肺臟，下補(bǔ)腎臟。明·汪綺石《理虛元鑒》中說：“治虛有三本，肺脾腎是也?！卑l(fā)酵蟲草菌粉可用于肺腎兩虛導(dǎo)致的精氣不足，神疲乏力，不寐健忘，腰膝酸軟，月經(jīng)不調(diào)，陽痿早泄等癥，不但與CFS癥狀相符合，也符合治虛治則。

本研究顯示：①中藥發(fā)酵蟲草菌粉膠囊能夠縮短慢性疲勞大鼠的懸掛不動(dòng)時(shí)間、記憶成績(jī)等疲勞指標(biāo)，降低慢性疲勞狀態(tài)下血漿ACTH、CORT水平且隨劑量的增大而效果明顯。②對(duì)抗慢性疲勞狀態(tài)下ACTH、CORT的增加，抑制HPA軸的功能亢進(jìn)可能是發(fā)酵蟲草菌粉治療CFS有效的機(jī)制之一。