高 盼 劉睿杰 王興國(guó)

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023)(大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；武漢輕工大學(xué)2，武漢 430023)(江南大學(xué)食品學(xué)院3,無(wú)錫 214122)

鐵核桃是我國(guó)獨(dú)有的核桃種類，主要生長(zhǎng)于我國(guó)高海拔的西南部地區(qū)。鐵核桃是常綠喬木，樹(shù)體高大，抗寒抗病性優(yōu)越，產(chǎn)量也較高，是良好的生態(tài)型經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1]。由于鐵核桃極易存活，多長(zhǎng)于野外，不占用耕地等優(yōu)良性能，近幾年在我國(guó)云南、西藏等地被大量種植，是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)林業(yè)作物，鐵核桃在我國(guó)核桃資源的占比逐年增加，現(xiàn)已成為我國(guó)兩大主要核桃種類之一。鐵核桃是我國(guó)獨(dú)有的核桃油原料，由于其種植成本較低，深受核桃油生產(chǎn)企業(yè)的歡迎，但鐵核桃油的相關(guān)研究很少[2，3]，其功能特性尚不清楚。

加工方式是影響核桃油組成特性的主要因素之一，油脂的品質(zhì)強(qiáng)烈地依賴于所使用的加工方法[4]，通過(guò)不同方法提取的堅(jiān)果油品質(zhì)特性有所差異[5]，為了獲得營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的核桃油，必須采用適當(dāng)?shù)募庸し椒?。低溫壓榨是一種傳統(tǒng)的提取堅(jiān)果油的方法，已廣泛用于制取杏仁油、南瓜子油和松子油中，也是最為常見(jiàn)的核桃油制取方法[6]。焙烤壓榨能增強(qiáng)風(fēng)味[7]，作為一種加工前處理方式也廣泛用于種子或果仁的食用油制備，但除了Vaidya和Eun[8]報(bào)道了焙烤壓榨-正己烷浸出對(duì)薄皮核桃油理化特性和氧化穩(wěn)定性的研究以外，焙烤壓榨較少應(yīng)用于核桃油中。溶劑浸出常用于堅(jiān)果油的工業(yè)萃取，因?yàn)檫@種加工方式可以提高油的產(chǎn)率[9]，易于蒸發(fā)且成本較低。目前實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)上使用的主流溶劑是正己烷[10]。亞臨界丁烷萃取與傳統(tǒng)的加工方法相比，具有安全、高效、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，在低溫下可通過(guò)系統(tǒng)減壓完全除去丁烷，萃取后的丁烷可完全回收[11]。超臨界二氧化碳萃取是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型制油方法，它不會(huì)造成萃取組分的熱降解，也不會(huì)導(dǎo)致萃取物中殘留溶劑[12]。這五種加工方式都具有極好的實(shí)用性，適合用來(lái)加工核桃油。

核桃油作為營(yíng)養(yǎng)油，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受關(guān)注，但目前鮮見(jiàn)鐵核桃油營(yíng)養(yǎng)研究報(bào)道。受中國(guó)傳統(tǒng)觀念的影響，對(duì)核桃油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的期待是具有健腦功效。研究發(fā)現(xiàn)，健腦與膽固醇代謝密切相關(guān)，通過(guò)對(duì)阿爾茨海默癥(AD)患者的尸檢報(bào)告[13]研究發(fā)現(xiàn)，有90%左右的AD患者生前同樣患有動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾?。挥信R床研究證實(shí)[14]，他汀類藥物可以通過(guò)降低膽固醇水平抑制癡呆的進(jìn)一步發(fā)展；更有大量的研究[15，16]證明，膽固醇代謝的相關(guān)基因，在AD中也具有顯著的影響。因此，認(rèn)為膽固醇代謝在AD的發(fā)病機(jī)制中可能起到了重要的作用[17]。同時(shí)核桃油對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用存在爭(zhēng)議[18-20]，膽固醇積累是動(dòng)脈粥樣硬化的根本原因，研究核桃油對(duì)膽固醇代謝的作用是研究核桃油抗動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)。因此，探索核桃油對(duì)膽固醇代謝的作用，對(duì)核桃油營(yíng)養(yǎng)功效的評(píng)估極為重要。膽固醇合成途徑如圖1所示。

圖1 膽固醇合成途徑

膽固醇的合成受到了多種酶和蛋白的綜合調(diào)控。SREBP-2位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，具有較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄激活域，是一種調(diào)節(jié)膽固醇合成的轉(zhuǎn)錄因子。SREBP-2可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)膽固醇合成[22]。HMGCR也存在于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，是膽固醇合成的限速酶，能決定膽固醇合成的快慢與程度，是SREBP-2下游的重要調(diào)控因子。HMGCR抑制劑是一種被廣泛使用的降膽固醇他汀類藥物[23]。CYP51屬于細(xì)胞色素P450家族，是膽固醇合成過(guò)程中催化羊毛甾醇轉(zhuǎn)化成膽固醇的作用酶，參與膽固醇合成的最后一步[24]。

HepG2細(xì)胞作為人肝癌細(xì)胞株能夠表達(dá)參與膽固醇代謝相關(guān)的酶和蛋白，極其適用于模擬人體正常肝臟細(xì)胞，是合適的膽固醇代謝模型細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)以不同加工方式的鐵核桃油為原料，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建膽固醇評(píng)價(jià)模型，檢測(cè)膽固醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，探索鐵核桃油對(duì)膽固醇合成的功效及作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鐵核桃采自新疆維吾爾自治區(qū)的漾泡鐵核桃大型商業(yè)種植園，于當(dāng)年8—9月采摘，經(jīng)過(guò)脫青皮和清洗處理后，立刻運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，在45 ℃下恒溫干燥3 d，使核桃含水量降至6%～8%。鐵核桃樣品保存在-80 ℃的冷庫(kù)中，核桃油采用密封性好的深色容器放置于-20 ℃中，直至樣品檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

HepG2細(xì)胞系、DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、青霉素-鏈霉素(Gibco)、PBS(Hyclone)、胰蛋白酶、二甲亞砜(DMSO)。

總膽固醇試劑盒、RNAeasyTM動(dòng)物RNA抽提試劑盒(離心柱式)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fast Quant RT Kit(gDNase)、iTaqTMSYBR?Green SuperMix。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

R510旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，t25均質(zhì)機(jī)，CBE-5L亞臨界流體萃取實(shí)驗(yàn)室成套設(shè)備，超臨界CO2流體萃取裝置，HFG 50S WN螺旋壓榨機(jī)，F(xiàn)orma 310二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，NanoDrop-one微量紫外分光光度計(jì)，T100 PCR擴(kuò)增儀，CFX-Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，GelDoxXR+凝膠成像儀。

1.4 脂質(zhì)提取

由于鐵核桃外殼堅(jiān)硬，使用錘子和液壓機(jī)破殼，后人工分離核桃仁。

低溫壓榨：稱取核桃仁，使用HFG 50S WN螺旋壓榨機(jī)在室溫下進(jìn)行壓榨，選取的壓榨孔徑為6 mm，螺桿速度為20 r/min，壓榨溫度為(60±10) ℃，收集的油溫度為(40±2) ℃。

焙烤壓榨：稱取核桃仁，放入烘箱中焙烤，根據(jù)不同焙烤時(shí)間和焙烤溫度的比較，最終選擇160 ℃焙烤15 min，焙烤后核桃仁放入干燥器中冷卻，將冷卻后的焙烤核桃仁按低溫壓榨工藝制油。

浸出：稱取核桃仁并研磨成細(xì)粉，以正己烷為提取溶劑，核桃仁和溶劑按1∶5混合，然后使用均質(zhì)機(jī)以7 500 r/min的速度均質(zhì)5 min，再使用布氏漏斗過(guò)濾混合物。用相同體積的溶劑對(duì)殘余物進(jìn)行兩次再萃取，并將三次萃取的濾液合并。在真空條件下，通過(guò)真空控制使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器釋放溶劑，直到?jīng)]有溶劑蒸發(fā)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用氮?dú)馊コ赡軞埩舻娜軇?/p>

亞臨界：稱取核桃仁，核桃仁與丁烷的提取比例為1∶5，使用亞臨界設(shè)備進(jìn)行亞臨界丁烷萃取，實(shí)驗(yàn)溫度為40 ℃，壓力為0.5 MPa，反應(yīng)時(shí)間為2 h。

超臨界：稱取核桃仁，將核桃仁放入2 L的提取容器中，使用超臨界萃取系統(tǒng)，在35 MPa真空壓力下提取1 h，以99.999%純度的CO2注入超臨界萃取裝置，流速為0.5 L/min，熱交換器的溫度設(shè)定為50 ℃，分離器的溫度和壓力分別為40 ℃和9 MPa。

收集的核桃毛油進(jìn)行離心去除雜質(zhì)，離心轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，時(shí)間20 min，離心后，得到澄清的核桃油。將核桃油放置于棕色樣品瓶中，放置于4 ℃冰箱避光儲(chǔ)存。

1.5 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)按照美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏所(American Type Culture Collection，ATCC)的標(biāo)準(zhǔn)方法，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，將0.5×106個(gè)細(xì)胞接種于6 cm的培養(yǎng)皿中，加入89% DMEM+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，準(zhǔn)備給藥，給藥培養(yǎng)基為99% DMEM+1%青霉素-鏈霉素。

1.6 HepG2細(xì)胞毒性檢測(cè)

根據(jù)Wolfe等[25]實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行條件優(yōu)化，采用亞甲基藍(lán)染色法測(cè)定不同濃度的核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將核桃油溶解于DMSO中，配制成不同濃度的核桃油-DMSO溶液。另外增設(shè)調(diào)零組(不含細(xì)胞和樣品)、空白對(duì)照組(含有細(xì)胞但不含樣品)，和陽(yáng)性對(duì)照組(含有細(xì)胞和千分之一的DMSO)。置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入亞甲基藍(lán)染色液(98%HBSS+0.67%戊二醛+亞甲基藍(lán))。37 ℃孵育1 h后去除染色液，充分洗滌后加入洗脫液(49% PBS+50%乙醇+1%乙酸)，搖床低速振蕩20 min，使染色液充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570 nm處各孔的吸光值。以DMEM培養(yǎng)液調(diào)零組調(diào)零，空白對(duì)照組作為對(duì)照，計(jì)算HepG2細(xì)胞活力，選取處理HepG2細(xì)胞的最佳核桃油-DMSO濃度。

1.7 總膽固醇的測(cè)定

將HepG2細(xì)胞處理后，細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組添加DMSO，實(shí)驗(yàn)組添加最佳濃度的核桃油-DMSO溶液。培養(yǎng)48 h，加入150 μL RIPA裂解液使細(xì)胞完全破碎，根據(jù)TC的試劑盒使用方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 q-PCR檢測(cè)

采用RNA抽提試劑盒提取總RNA，檢測(cè)RNA的純度和完整性后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA為模板，選取適當(dāng)濃度，配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，其擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃/2 min；95 ℃/5 s，60 ℃/30 s，(40個(gè)循環(huán))；72 ℃/5 min。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取斜率在2左右，CT值在20～30之間對(duì)應(yīng)的濃度作為后續(xù)檢測(cè)的cDNA反應(yīng)濃度。使用GAPDH作為對(duì)照基因，每個(gè)樣品重復(fù)三次，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上，核桃油組成特性的數(shù)據(jù)以mean±SD表示。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Tukey′s-b檢驗(yàn)對(duì)所有參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，ANOVA實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異在5%水平顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

采用亞甲基藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率，其檢測(cè)原理是亞甲基藍(lán)可以結(jié)合核酸，使活細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色。本實(shí)驗(yàn)使用亞甲基藍(lán)染色法評(píng)估核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響，以不加樣品的細(xì)胞作為對(duì)照，以只加DMSO的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，研究核桃油的細(xì)胞毒性，以確定最佳的核桃油細(xì)胞添加量。不同濃度核桃油添加量對(duì)細(xì)胞活力的影響如圖2所示。當(dāng)DMSO的添加量為0.50%時(shí)，細(xì)胞活力為83.32%(<90%)，具有細(xì)胞毒性，而當(dāng)DMSO添加量為0.10%時(shí)，細(xì)胞活力為105.31%，選擇0.1%作為DMSO的細(xì)胞添加量。

注：*表示P<0.05，余同。

通過(guò)比較不同終濃度的核桃油添加量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)核桃油添加量為1 000 μg/mL時(shí)，其細(xì)胞活力具有明顯的抑制作用，顯著低于其他添加濃度的細(xì)胞活力，而核桃油添加量為500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力為112.74%，顯著高于空白對(duì)照組及DMSO陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)繼續(xù)減少核桃油的添加量對(duì)細(xì)胞活力的影響不大，因此，選擇500 μg/mL作為核桃油的添加量。

2.2 鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞TC含量的影響

圖3顯示了不同加工方式的鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞TC的影響。從圖3可以看出，與對(duì)照組相比，所有鐵核桃油都能顯著降低HepG2細(xì)胞的TC含量(P<0.05)，其中低溫壓榨鐵核桃油的TC降低極為顯著，下降了52.36%，而其他加工方式的樣品間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，大約降低了35.79%～42.60%。

注：字母表示在5%顯著水平的統(tǒng)計(jì)差異，余同。

2.3 鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇合成基因表達(dá)的影響

鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞HMGCR表達(dá)的影響如圖4所示。與對(duì)照組相比，只有低溫壓榨鐵核桃油和亞臨界鐵核桃油能顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞中HMGCR mRNA的表達(dá)量(P<0.05)，分別下調(diào)了37.67%和28.00%，而其他加工方式的鐵核桃油與對(duì)照組相比，雖然絕對(duì)值降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖4 鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞HMGCR表達(dá)的影響

圖5顯示了鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞SREBP-2表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比，只有亞臨界加工的鐵核桃油樣品能顯著下調(diào)SREBP-2 mRNA的表達(dá)量，大約下調(diào)了50%，而其他加工方式的鐵核桃油雖然從絕對(duì)值上略微下調(diào)了SREBP-2基因的表達(dá)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖5 鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞SREBP-2表達(dá)的影響

圖6顯示了鐵核桃油對(duì)CYP51基因表達(dá)的影響，不同加工方式的鐵核桃油都能顯著降低HepG2細(xì)胞中CYP51 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)，其中亞臨界和正己烷浸出的鐵核桃油對(duì)CYP51基因的調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)，分別下調(diào)了30.67%和26.33%。

圖6 核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞CYP51表達(dá)的影響

3 討論

雖然人體各個(gè)組織都可以合成膽固醇，但肝臟是膽固醇合成的主要場(chǎng)所[26]。HepG2細(xì)胞作為人肝癌細(xì)胞株能夠表達(dá)參與膽固醇代謝相關(guān)的酶和蛋白，極其適用于模擬人體正常肝臟細(xì)胞，是合適的膽固醇代謝模型細(xì)胞系。細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成主要分為五個(gè)步驟：3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A，HMG-CoA)在HMG-CoA還原酶(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase，HMGCR)的催化下，生成二羥甲基戊酸；生成的二羥甲基戊酸在酶的催化作用下，異構(gòu)化生成異戊烯醇焦磷酸酯；異戊烯醇焦磷酸酯在異構(gòu)酶的作用下生成二甲丙基焦磷酸，之后經(jīng)過(guò)一系列的酶促反應(yīng)最終聚合生成鯊烯；鯊烯經(jīng)酶的作用，環(huán)化生成羊毛甾醇；羊毛甾醇經(jīng)氧化、脫羧、還原等反應(yīng)生成膽固醇[27]。

鐵核桃油誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞后，下調(diào)HMGCR基因的表達(dá)，減少膽固醇合成過(guò)程中二羥甲基戊酸的含量；由于SREBP-2表達(dá)量的下調(diào)，從膜中釋放的SREBP N端結(jié)構(gòu)域減少，進(jìn)入細(xì)胞核后，與基因結(jié)合減少；合成反應(yīng)中生成的羊毛甾醇由于其催化酶CYP51表達(dá)量的減少，使其轉(zhuǎn)化成膽固醇的含量也下降，基于HMGCR、SREBP-2和CYP51基因的調(diào)控，使膽固醇的合成減少，影響了膽固醇代謝，使TC含量降低，起到了降膽固醇的作用。

Zhang等[28]使用核桃油誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞衍生泡沫細(xì)胞，也能降低細(xì)胞的TC含量，但該研究認(rèn)為核桃油對(duì)膽固醇合成沒(méi)有影響，會(huì)影響膽固醇的排泄，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一致，造成這種現(xiàn)象的原因可能是選擇的細(xì)胞模型不一樣，HepG2細(xì)胞作為肝癌細(xì)胞主要表達(dá)膽固醇在肝臟內(nèi)合成和轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因，而THP-1巨噬細(xì)胞衍生泡沫細(xì)胞主要表征膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)和外排相關(guān)的表達(dá)。

根據(jù)對(duì)不同加工方式的鐵核桃油組成特性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)[29](實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)附錄)，不同加工方式的鐵核桃油具有相似的脂肪酸組成和甘油三酯組成，以及差異較大的微量伴隨物含量。因此推測(cè)鐵核桃油中引起膽固醇合成功效差異的物質(zhì)，可能是核桃油中的微量伴隨物。

油脂中微量伴隨物對(duì)膽固醇代謝的影響已有報(bào)道。程敏[30]發(fā)現(xiàn)，相比于精煉椰子油，含有豐富微量伴隨物的初榨椰子油具有更好的降膽固醇功效，但是比較棕櫚油發(fā)現(xiàn)，生育酚含量更少的精煉棕櫚油比天然的巴西棕櫚油具有更好的降TC和TG作用[31]，精煉莧菜油與莧菜原油的研究也有相似的結(jié)果[32]。造成這種現(xiàn)象的可能原因是微量伴隨物的含量不是越高越好，而是存在一定的量效關(guān)系。因此，優(yōu)選鐵核桃油的加工方式，會(huì)影響其降膽固醇的功效，同時(shí)，在鐵核桃油的生產(chǎn)過(guò)程中，需要更加重視其微量伴隨物的含量，這些微量成分對(duì)鐵核桃油的功能特性影響極大。

4 結(jié)論

本研究以五種不同加工方式制備的鐵核桃油為原料，檢測(cè)了鐵核桃油對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇合成代謝的影響和作用機(jī)制，證明了鐵核桃油能通過(guò)調(diào)節(jié)膽固醇合成基因HMGCR，SREBP-2和CYP51基因的表達(dá)，減少HepG2細(xì)胞的膽固醇合成，起到降膽固醇的作用。結(jié)合不同加工方式鐵核桃油的組成特性結(jié)果分析，推測(cè)鐵核桃油中的微量伴隨物是影響其膽固醇合成作用的主要物質(zhì)。