王先松，郭世洪，趙 瑤，張德志,2，李前勇,2

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460 ; 2.重慶市獸醫(yī)工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460)

豬Delta冠狀病毒病是由豬Delta冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)引起的豬的一種急性腸道傳染病，各生長(zhǎng)階段豬均能感染，哺乳仔豬最易感。被感染豬主要表現(xiàn)為持續(xù)嘔吐、水樣腹瀉和脫水等癥狀。該病病原最先于2012年在我國(guó)香港發(fā)現(xiàn)，隨后在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)被檢測(cè)出。有資料指出，該病將會(huì)在我國(guó)及周邊呈現(xiàn)大量發(fā)生，嚴(yán)重威脅著生豬健康及養(yǎng)豬業(yè)安全。

1 PDCoV的病原特征與流行病學(xué)

PDCoV是屬于尼多病毒目(Nidovirales),冠狀病毒科(Coronaviridae),冠狀病毒屬(Coronavirus)的單股正鏈RNA病毒，電鏡下呈直徑80～160 nm的球體，有典型的冠狀顆粒?；蚪M大小為25.421～26.674 kb，是最小的冠狀病毒，共編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白，基因組排列順序?yàn)?′非編碼區(qū)(5′UTR)、開放閱讀框(ORF1A/1B)、纖突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、非結(jié)構(gòu)蛋白NS6、核衣殼蛋白(N)、非結(jié)構(gòu)蛋白NS7、3′非編碼區(qū)(3′UTR)，與其他動(dòng)物的Delta冠狀病毒基因組特征和結(jié)構(gòu)相似[1-2]。

自2012年P(guān)DCoV首次在香港被檢出，隨后在美國(guó)、加拿大、日本、韓國(guó)、老撾、越南和泰國(guó)等國(guó)家已發(fā)現(xiàn)了數(shù)十株P(guān)DCoV毒株[3-6]。同時(shí)PDCoV也在我國(guó)黑龍江、廣東、廣西、海南、四川、臺(tái)灣、貴州、湖北等多個(gè)地區(qū)被檢測(cè)到，表明PDCoV流行趨勢(shì)越來越嚴(yán)重。由于冠狀病毒獨(dú)特的基因組復(fù)制方式，PDCoV的RNA極易發(fā)生突變和重組，使該病的預(yù)防和控制變得更加困難[7]。

2 PDCoV病的癥狀與致病機(jī)制

PDCoV能夠感染各日齡豬群，以豬腸絨毛萎縮、嘔吐、腹瀉和脫水為特征，尤其對(duì)哺乳仔豬具有較強(qiáng)的致病性，病死率一般為30%～40%，有時(shí)可高達(dá)100%。剖檢可見腸壁變薄、腸腔內(nèi)充滿黃色液體，胃和小腸內(nèi)有未消化的凝乳塊，有的小腸黏膜充血、出血，腸系膜呈索狀充血等[8]。

病毒接種仔豬后4～7 d內(nèi)觀察到腸絨毛萎縮，隱窩深度增加。研究者用免疫組織熒光法只能在感染豬的十二指腸、空腸、回腸檢測(cè)到熒光，而用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法在腸道、腸系膜淋巴結(jié)、胃、心、肝、脾、肺、腎、扁桃體、膈肌、肌肉、血液中均檢測(cè)到該病毒，與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的結(jié)果不一致[9-10]。PDCoV的致病機(jī)制尚不完全清楚，最新研究表明，存在于細(xì)胞膜和病毒包膜中的膽固醇，通過作為病毒進(jìn)入的關(guān)鍵成分而促進(jìn)PDCoV復(fù)制[11]。Wang等發(fā)現(xiàn)PDCoV使用豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroonteritis virus, TGEV)功能受體-豬氨基肽酶N(pAPN)進(jìn)入細(xì)胞，證明pAPN是跨屬冠狀病毒的功能受體，該受體的鑒定為進(jìn)一步研究PDCoV與宿主的相互作用及發(fā)病機(jī)制提供了重要參考[12]。

3 PDCoV病的診斷

鑒于PDCoV病的臨床癥狀和病理變化與豬流行性腹瀉(Porcine epizootic diarrhea, PED)、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroonteritis,TGE)、仔豬黃痢等豬腸道疾病非常相似，且易發(fā)生混合感染，臨床上難以鑒別診斷。目前，對(duì)PDCoV病的診斷主要有病原學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷(表1)。

3.1 病原學(xué)診斷

表1 PDCoV檢測(cè)

3.1.1 病毒分離培養(yǎng)鑒定 病毒的分離培養(yǎng)可為PDCoV感染提供最直接的病原學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步的病毒學(xué)研究提供材料。Jang等將PDCoV陽(yáng)性樣本接種到豬睪丸(ST)細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離傳代,成功分離得到了PDCoV HB-BD株。通過對(duì)分離株的S、M和N基因進(jìn)行測(cè)序鑒定及經(jīng)序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)HB-BD分離株S、M和N基因與近年來國(guó)內(nèi)外的流行病毒核苷酸同源性分別為95.8%～99.1%、98.6%～99.4%和97.8%～99.4%，親緣性分析表明，HB-BD與中國(guó)毒株處于同一分支[13]。

3.1.2 電子顯微鏡檢查 電鏡技術(shù)可以最直觀地觀察到PDCoV粒子的形態(tài)和大小。Xu等使用電子顯微鏡對(duì)純化的PDCoV CHN-GD-2016進(jìn)行檢測(cè)，觀察到PDCoV病毒粒子呈直徑80～160 nm的球形，粒子外包裹著一層囊膜，囊膜外有密集的尖刺狀纖突[2]。由于病毒粒子形態(tài)和其他冠狀病毒差別不大，僅從形態(tài)學(xué)上很難確診PDCoV，因此需要結(jié)合其他手段才能準(zhǔn)確診斷。

3.1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) RT-PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于RNA病毒檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)微量的核酸大幅擴(kuò)增，提高檢測(cè)效率。韋學(xué)雷等根據(jù)PDCoVN基因、PEDVM基因和TGEVN基因設(shè)計(jì)合成了3對(duì)特異性引物,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并對(duì)RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了檢測(cè)PDCoV, PEDV和TGEV的多重RT-PCR診斷方法，結(jié)果顯示，與常規(guī)單一RT-PCR的結(jié)果完全符合，且能有效避免對(duì)豬博卡病毒(PboV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬圓環(huán)病毒(PCV)等豬常見病毒的誤診[14]。Hu等根據(jù)編碼Alpha、Beta、Gamma和Delta冠狀病毒最保守的蛋白結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)了1套新的引物來擴(kuò)增RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)基因中的668 bp區(qū)域，建立一步法RT-PCR測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，反轉(zhuǎn)錄和PCR順次進(jìn)行,其敏感性和特異性為100%，可鑒別診斷動(dòng)物的4種冠狀病毒，且檢出率高于普通RT-PCR方法[15]。

3.1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(RT-qPCR) 相比RT-PCR，RT-qPCR檢測(cè)方法更快速、更靈敏，逐漸被廣泛應(yīng)用于PDCoV檢測(cè)。Masuda等根據(jù)PEDV和TGEVN基因、PDCoVM基因和豬A型輪狀病毒(PRVA)VP6基因開發(fā)了一種新的多重Real time RT-PCR方法，可以在75 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)4種豬腹瀉病毒，大大縮短診斷時(shí)間，其敏感性最高可達(dá)普通RT-PCR的1 000倍，而且沒有出現(xiàn)假陽(yáng)性[5]。張立衛(wèi)等根據(jù)PDCoV毒株HKU15-155M基因和PEDV毒株CHLY-09ORF3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,建立并完善了能同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)PDCoV和PEDV的SYBR Green I雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，具有良好的敏感性和特異性[16]。

3.1.5 恒溫絕熱式RT-PCR(RT-iiPCR) RT-iiPCR與傳統(tǒng)的RT-PCR檢測(cè)方法相比,具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、特異性強(qiáng)、儀器成本低等優(yōu)點(diǎn)，已開始運(yùn)用于各種病原體的檢測(cè)。Zhang等使用PDCoVM基因，建立了PDCoV RT-iiPCR檢測(cè)方法并與基于M基因的PDCoV RT-qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，PDCoV RT-iiPCR的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性均為100%[17]，具有極好的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。

3.1.6 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP) RT-LAMP為快速準(zhǔn)確地鑒定病毒病原體提供了有效手段，其在等溫條件下擴(kuò)增出具有高靈敏度和特異性的核酸，這種新型基因檢測(cè)技術(shù)有效地節(jié)省了時(shí)間和成本。Zhang等使用PDCoVN基因的保守序列片段作為靶區(qū)域，開發(fā)了單管一步法RT-LAMP法用于PDCoV診斷和監(jiān)測(cè)，其靈敏度比RT-PCR高約100倍，且與PEDV、TGEV等6種病毒無交叉擴(kuò)增[17]，特異性良好，是一種具有研究?jī)r(jià)值的方法。

3.2 免疫學(xué)診斷

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) ELISA是血清學(xué)檢測(cè)的常用方法之一。與其他豬冠狀病毒相比，用于PDCoV病的ELISA診斷方法仍處于研發(fā)階段。2015年Thachil等基于PDCoV-IA2014-1株S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域開發(fā)了間接ELISA，用于測(cè)定美國(guó)51個(gè)農(nóng)場(chǎng)的PDCoV流行情況,發(fā)現(xiàn)在25.5%的農(nóng)場(chǎng)中存在抗PDCoV IgG抗體，診斷靈敏度為91%，特異性為95%[18]。SU等開發(fā)了一種間接ELISA，以組織標(biāo)記的重組PDCoV N蛋白作為抗原檢測(cè)PDCoV的抗體，均未與TGEV、PEDV、豬輪狀病毒A型(Porcine group A rotavi ruses, GAR)、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV發(fā)生交叉反應(yīng),具有100%的敏感性和90.4%的特異性[19]。國(guó)內(nèi)Luo等建立了以PDCoV M蛋白為基礎(chǔ)的間接ELISA法，檢測(cè)了河北省抗PDCoV IgG情況，與抗TGEV、PEDV、RV、PCV-2、CSFV和PRRSV的抗血清無交叉反應(yīng)，診斷敏感性為90.6%，特異性為93.3%[20]。

3.2.2 熒光微球免疫檢測(cè)(FMIA) FMIA方法又被稱為液相芯片技術(shù)，是集流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的生物分子檢測(cè)技術(shù)。Okda等使用碳化二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)將純化的重組PDCoV N蛋白抗原與熒光微球偶聯(lián)，優(yōu)化條件后得到最佳信噪比，診斷特異性為95.8%，敏感性為98.1%[21]。該方法敏感性通常高于ELISA，且適用于單一復(fù)雜樣品中不同分析物的高通量、多重和同時(shí)檢測(cè)，是一種正在發(fā)展的新型檢測(cè)技術(shù)。

3.2.3 免疫熒光試驗(yàn)(IFA) Zhang等通過擴(kuò)增PDCoV的N基因，用抗PDCoV N蛋白的單抗IFA和Western Blot檢測(cè)了純化的PDCoV CHN-HG-2017株在LLC-PK1細(xì)胞中的傳染性。在感染后24 h時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞中檢測(cè)到PDCoV特異性免疫熒光，N蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中[22]。

3.2.4 病理切片和免疫組織化學(xué)染色(IHC) Zhang等將被感染豬十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸組織制作成H.E.染色石蠟切片，結(jié)果顯示，PDCoV感染仔豬的空腸和回腸絨毛變鈍、碎裂，出現(xiàn)萎縮和空泡，淋巴細(xì)胞聚集和腸固有層充血。用PDCoV N特異性單克隆抗體孵育，然后用HRP綴合的山羊抗小鼠IgG二抗孵育的IHC結(jié)果與病理切片結(jié)果一致，在感染絨毛腸細(xì)胞的胞漿中檢測(cè)到PDCoV抗原[22]。IFA 及 IHC 等原位檢測(cè)方法主要優(yōu)勢(shì)在于可以顯示PDCoV抗原的組織分布，但由于該方法的分析靈敏度較低，不能成為檢測(cè)PDCoV的首選方法，多用于檢測(cè)感染期抗體狀況。

4 PDCoV病的防控措施

由于目前關(guān)于PDCoV的感染和傳播研究較少，而且沒有針對(duì)PDCoV開發(fā)有效商業(yè)化疫苗或治療藥物，因此只能借鑒其他病毒性腹瀉病PED、TGE采取的綜合性防制措施，從養(yǎng)豬生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)入手，堅(jiān)持“預(yù)防為主，防重于治”原則，以減少疾病發(fā)生。

4.1 合理選擇場(chǎng)址，嚴(yán)格引種檢疫 場(chǎng)址應(yīng)選在地勢(shì)較高，干燥，陽(yáng)光充足，水源良好，排污方便，污染較少的地方。豬場(chǎng)應(yīng)遠(yuǎn)離公路、城鎮(zhèn)居民區(qū)。生活區(qū)與生產(chǎn)區(qū)、隔離區(qū)要嚴(yán)格分開。引種前要確定所引進(jìn)的豬已經(jīng)有可靠的免疫,種源豬場(chǎng)應(yīng)出具檢疫證明。引種后需隔離觀察1-2個(gè)月，經(jīng)檢疫合格后方可與本場(chǎng)豬合群。

4.2 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提升抵抗能力 養(yǎng)殖場(chǎng)要提高飼料營(yíng)養(yǎng)水平，杜絕飼喂變質(zhì)飼料，保持營(yíng)養(yǎng)平衡，從而提高豬只健康水平及其抵抗力。做好場(chǎng)內(nèi)的生物安全，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出原則。保持圈舍干凈，減少病毒通過糞-口傳播，保證通風(fēng)換氣，做好母豬產(chǎn)前乳房清潔和消毒以及產(chǎn)房的保溫工作，同時(shí)應(yīng)降低濕度，給予充足而干凈的飲水，不要頻繁地更換飼料。

4.3 重視消毒工作，輔以適當(dāng)給藥 及時(shí)控制傳染源，切斷傳播途徑，隔離已感染豬群和保護(hù)易感豬只；做好消毒工作，對(duì)清潔后的豬場(chǎng)使用化學(xué)消毒液消毒，增加對(duì)疫區(qū)的消毒頻次。對(duì)發(fā)病豬可使用抗生素、抗炎藥、抗病毒藥物和液體電解質(zhì)等，減少脫水和體重減輕等癥狀，降低因細(xì)菌或病毒的繼發(fā)感染而引起的死亡。KM等發(fā)現(xiàn)市售飼料酸化劑(UltraAcid P,Activate D A,KEMGEST,Acid Booster, Luprosil, Amasil)和鹽可降低飼料中傳播PDCoV的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在推薦濃度的2倍下可降低飼料中PDCoV的含量，但不能使病毒完全滅活[23]。有報(bào)道稱，多克隆免疫血清可用于控制已發(fā)病豬群的感染[24]。

4.4 做好預(yù)防接種，減少混合感染 結(jié)合當(dāng)?shù)氐膭?dòng)物疫情以及養(yǎng)殖場(chǎng)的生產(chǎn)實(shí)際情況制定合理的免疫程序，避免PDCoV與PEDV、TGEV、GAR等腹瀉疾病混合感染。提高母豬的基礎(chǔ)免疫可使仔豬獲得高濃度的母源抗體，增強(qiáng)初生仔豬的抵抗力。國(guó)內(nèi)常見有哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)的PEDV、TGEV、GAR三聯(lián)弱毒苗以及多種PEDV、TGEV、GAR三聯(lián)滅活疫苗和PEDV、TGEV二聯(lián)滅活疫苗等，各豬場(chǎng)可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行預(yù)防接種，控制仔豬腹瀉疾病，減少與PDCoV的混合感染。

5 展望

PDCoV作為一種新發(fā)現(xiàn)的致病性病毒，人們對(duì)其的分子病原學(xué)、流行病學(xué)、致病機(jī)制等了解尚不夠全面和深入，對(duì)PDCoV的預(yù)防和治療方法的研究也較少。加強(qiáng)對(duì)該病毒NS6和其他輔助蛋白的功能的研究，可能對(duì)尋找新的治療靶點(diǎn)和開發(fā)有效疫苗提供依據(jù)。已建立的PDCoV反向遺傳系統(tǒng)，對(duì)研究病毒基因的突變或缺失、探索NS6缺失對(duì)IFN-β產(chǎn)生、病毒復(fù)制和宿主譜的影響等有很積極的意義。從當(dāng)前全球PDCoV流行狀況來看，該病毒蔓延速度非?？欤⒖赡軙?huì)在我國(guó)全面流行，因此迫切需要研制出針對(duì)PDCoV的疫苗來控制本病的傳播。