蘆天文，劉寶濤，張啟迪，劉煥奇，鄒 明

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

大腸桿菌感染被認(rèn)為是奶牛乳房炎和犢牛腹瀉的重要原因之一[1]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了不可估計的損失。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)可以水解青霉素和第3代頭孢菌素(3GCs)的β-內(nèi)酰胺類化合物，它們主要存在于腸桿菌科中[2]。

blaCTX-M是ESBLs的主要流行基因型，1989年在德國首次報道后流行率逐漸提高[3]。攜帶blaCTX-M大腸桿菌在動物(家畜和寵物)的廣泛傳播已經(jīng)成為了一個全球性的衛(wèi)生問題，產(chǎn)ESBLs大腸桿菌可能通過食物鏈轉(zhuǎn)移給人。CTX-M-1 group被發(fā)現(xiàn)是動物源大腸桿菌的主要流行亞型[4]，其次是CTX-M-9 group。[3]

家禽和豬的產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌報道較多且流行率較高，然而牛源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌尤其是牛場環(huán)境樣品的報道很少，本試驗通過對山東青島地區(qū)22個奶牛場分離到的782株牛源大腸桿菌篩選了blaCTX-M超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，并測定了最小抑菌濃度(MIC)，旨在了解青島地區(qū)blaCTX-M耐藥基因的流行情況和耐藥情況，為臨床使用頭孢菌素類藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 對山東省青島地區(qū)22個奶牛場進(jìn)行樣品采集，分別采取牛奶877份、糞便樣品477份、飲水樣品54份、污水樣品60份及土壤樣品91份，共1 616份樣品。

1.2 試劑及藥品 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、LB肉湯、MH肉湯和MH瓊脂，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Taq酶、Marker 2 000， 均購自TaKaRa試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 增菌培養(yǎng) 將牛奶樣品6 000 r/min離心5 min 后棄上清，加入LB肉湯混勻，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。將糞便樣品在含有生理鹽水的離心管混勻后吸出100 μL加入LB肉湯中混勻，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。 將飲水和污水樣品吸取100 μL加入到LB肉湯中混勻，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。將土壤樣品加入一定量的LB肉湯中混勻，吸取100 μL加入到LB肉湯中混勻，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。

1.3.2 大腸桿菌的分離 菌液在麥康凱培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)特征。

1.3.3 大腸桿菌的純化 將疑似大腸桿菌菌落接種在伊紅美藍(lán)平板上培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)特征。

1.3.4 DNA模板的制備 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板。

1.3.5 耐藥基因blaCTX-M的擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)[5]檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaCTX-M-1G、blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G、blaCTX-M-9G、blaCTX-M-25G,使用25 μL PCR體系擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測條帶，測序。

1.3.7 ESBLs確證試驗 對陽性大腸桿菌采用美國臨床和試驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦紙片擴(kuò)散法進(jìn)行ESBLs的表型確證試驗，頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸雙紙片，若抑菌環(huán)直徑之差≥5 mm，即判定為ESBLs陽性菌株。

1.3.8 藥敏試驗 大腸桿菌菌ATCC 25922作為藥敏試驗的質(zhì)控菌株。對PCR擴(kuò)增得到的陽性大腸桿菌，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)采用瓊脂稀釋法對慶大霉素、萘啶酸、多西環(huán)素、恩諾沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、鏈霉素、頭孢呋辛、氨芐青霉素、頭孢噻呋、卡那霉素、氟苯尼考、阿米卡星、美羅培南、磷霉素共17種抗生素進(jìn)行藥敏試驗，獲得其最小抑菌濃度(MIC)值，用肉湯稀釋法對多黏菌素、替加環(huán)素測定敏感度，判斷藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離純化 青島地區(qū)22個奶牛場共分離到疑似大腸桿菌782株，其中牛奶源203株，分離率23.1%(203/877)；糞源477株，分離率100%(477/477)；飲水源19株，分離率35.1%(19/54)；污水源51株，分離率85%(51/60)；土壤源32株，分離率35.1%(32/91)。

2.2 PCR擴(kuò)增 經(jīng)PCR鑒定，共擴(kuò)增到疑似blaCTX-M-1G目的條帶菌株27株，疑似blaCTX-M-9G目的條帶菌株16株，未檢測到blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G、blaCTX-M-25G疑似條帶(共42株陽性大腸桿菌，其中1株大腸桿菌同時含有blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G)，挑選PCR產(chǎn)物測序BLAST比對，相似度高于99%確定為目的條帶。

2.3 ESBLs確證試驗 用雙紙片協(xié)同試驗確證42株大腸桿菌均產(chǎn)ESBLs。42株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中16株來源于牛奶源大腸桿菌、16株來源于糞源大腸桿菌、1株來源于飲水源大腸桿菌、7株來源于污水源大腸桿菌、2株來源于土壤源大腸桿菌。牛源大腸桿菌blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G檢出率統(tǒng)計見表1。各牛場牛源大腸桿菌blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G檢出率統(tǒng)計見表2和表3。

表1 牛源大腸桿菌blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G檢出率Table 1 Detection rates of blaCTX-M-1G and blaCTX-M-9G from bovine Escherichia coli

表2 22個奶牛場的blaCTX-M-1G檢出率Table 2 Detection rate of blaCTX-M-1G in 22 dairy farms %(blaCTX-M-1G陽性大腸桿菌數(shù)/大腸桿菌數(shù)) % (blaCTX-M-1G positive E. coli / E. coli)

表3 22個奶牛場的blaCTX-M-9G檢出率Table 3 Detection rate of blaCTX-M-9G in 22 dairy farms %(blaCTX-M-1G陽性大腸桿菌數(shù)/大腸桿菌數(shù)) % (blaCTX-M-1G positive E. coli / E. coli)

2.4 藥敏試驗 42株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢呋辛和氨芐西林均耐藥；對替加環(huán)素、阿米卡星和美羅培南均敏感；對氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星(7.1%)、左氧氟沙星(7.1%)、萘啶酸(28.5%)和恩諾沙星(9.5%)均有一定的耐受性；對氨基糖苷類藥物慶大霉素和卡那霉素耐受性較低，為2.3%和7.1%；鏈霉素較高，為26.1%；四環(huán)素類藥物四環(huán)素為35.7%、多西環(huán)素為28.5%；多磷類抗生素磷霉素為7.1%；多肽類抗生素多黏菌素較高，為47.6%；獸醫(yī)專用酰胺醇類藥物氟苯尼考耐受性為16.6%。多重耐藥主要是以2耐、3耐為主，分別占到38.0%和26.2%，3耐及3耐以上占到47.4%，有4株耐6類抗生素。見表4、表5。

表4 42株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的多重耐藥統(tǒng)計Table 4 Multi-drug resistance statistics of 42 ESBLs-producing Escherichia coli

表5 42株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果Table 5 Drug susceptibility test results of 42 ESBLs-producing Escherichia coli

3 討論

3.1 牛源大腸桿菌的分離率分析 本試驗對青島地區(qū)22個奶牛場采集的1 616份樣品，共分離到782株大腸桿菌，其中牛奶樣品分離率23.1%(203/877)，高于Yang等[6]分離率11.1%。環(huán)境樣品(飲水、污水和土壤)分離率49.7%，明顯高于郭春燕[7]15%～23%，主要是由于本試驗采集了污水樣品。大腸桿菌的分離率較高，表明部分奶牛場存在較為嚴(yán)重的大腸桿菌污染情況，牛場的管理人員應(yīng)加強管理，增強管理人員和一線工人的操作規(guī)范，減少細(xì)菌的滋生和污染風(fēng)險。

3.2 大腸桿菌blaCTX-M檢出率分析 篩選了β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaCTX-M, 未檢測到blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G、blaCTX-M-25G耐藥基因，結(jié)果顯示，其他3種亞型未在青島地區(qū)牛場廣泛傳播。

攜帶blaCTX-M-1G大腸桿菌分離率為3.5%，與方光遠(yuǎn)等[8]牛源大腸桿菌檢出率3.7%結(jié)果相近，相比較檢出率明顯低于郭翠平等[9]山東省禽源檢出率28%。本試驗分離到1株飲水源和6株污水源大腸桿菌攜帶blaCTX-M-1G基因，其中有4株污水源來源于場11和場13，由表2可以看出，場11和場13肛門拭子大腸桿菌中有著較高的blaCTX-M-1G基因檢出率；另1株飲水源和2株污水源來源于場12和場20，我們發(fā)現(xiàn)在這兩家奶牛場的牛奶樣品和肛門拭子樣品中均未檢出到blaCTX-M-1G基因。

攜帶blaCTX-M-9G基因大腸桿菌分離率為2.0%，檢出率低于郭翠平等[9]山東省禽源檢出率37.3%，楊守深等[10]豬源檢出率17.4%。牛奶中大腸桿菌的檢出率(4.4%)明顯要高于糞便樣品(0.6%)。1株污水源和2株土壤源大腸桿菌中檢出到blaCTX-M-9G基因，除1株污水源來源于檢出率較高的場11，另1株污水源大腸桿菌和1株土壤源大腸桿菌來源于場5和場20，此兩場其他樣品均未檢測到blaCTX-M-9G基因。

3.3 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌的耐藥性分析 使用瓊脂稀釋法對42株攜帶blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G基因的大腸桿菌，測定19種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)。42株大腸桿菌對頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢呋辛和氨芐青霉素均耐藥，與Yang等[6]的結(jié)果一致；對美羅培南耐藥率0%，與Yang等[6]結(jié)果一致。氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星(7.1%)、左氧氟沙星(7.1%)均低于Yang等[6]的結(jié)果，而萘啶酸(28.5%)略高，恩諾沙星(9.5%)與南海辰等[11]結(jié)果一致。對氨基糖苷類藥物慶大霉素和卡那霉素耐受性較低，為2.3%和7.1%，鏈霉素較高，為26.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Yang等[6](70%～80%)的結(jié)果。據(jù)報道，近期有攜帶ESBLs的質(zhì)粒同時攜帶氟喹諾酮、氨基糖苷等耐藥基因廣泛傳播，可能是這兩類抗生素耐受性差距較大的原因，表明此類質(zhì)粒未在青島地區(qū)廣泛傳播。

四環(huán)素類藥物四環(huán)素(35.7%)和多西環(huán)素(28.5%)有著較高的耐受性可能與牛場有四環(huán)素藥物的用藥史有關(guān)，替加環(huán)素作為一種新的四環(huán)素抗生素,可用于產(chǎn)ESBLs的革蘭陰性菌，此次試驗菌株耐受率為0%。多磷類抗生素磷霉素7.1%低于李明舉等[12]29.2%。多黏菌素47.6%低于劉華棟等[13]64.7%，主要是多黏菌素以前被用作促生長劑在獸醫(yī)臨床上使用。獸醫(yī)專用的酰胺醇類藥物氟苯尼考16.6%和軒慧勇等[14](16.7%)結(jié)果一致。

家禽和豬源的攜帶blaCTX-M基因大腸桿菌具有很高的流行率，然而牛源的數(shù)據(jù)卻低得多。環(huán)境可能是細(xì)菌水平傳播的中介，但是對于牛場的環(huán)境數(shù)據(jù)并不多，本試驗在牛場的飲水、污水和土壤中都分離到了不同數(shù)量攜帶blaCTX-M-1G或blaCTX-M-9G基因的大腸桿菌，為耐藥菌的水平傳播方式提供了數(shù)據(jù)支撐，為牛場用藥提供了理論指導(dǎo)。