張楠高波潘忠成張心心郭秀艷翁婧李蒲民

(1.陜西麥可羅生物科技有限公司，陜西 渭南715500；2.哈爾濱工程大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院教育部超輕材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150001)

前言

多抗霉素又叫多氧霉素，在日本是從可可鏈霉菌素阿索變種(S.ca ca oi var.asoensis)中分離到一種核苷類抗生素[3,8]，而在我國是金色產(chǎn)色鏈霉菌(S.aurea chromogemes,4896)的次級代謝產(chǎn)物。多抗霉素屬于廣譜性生物殺菌劑，具有較好的內(nèi)吸性傳導(dǎo)作用。其作用機(jī)理是抑制菌體細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的生物合成，使菌體細(xì)胞壁不能進(jìn)行生物合成而導(dǎo)致死亡，還能抑制病菌產(chǎn)孢和病斑擴(kuò)大[3,6]。多抗霉素主要用于蘋果斑點(diǎn)落葉病、梨黑星病、葡萄灰霉病、黃瓜霜霉病、番茄晚疫病、人參黑斑病等多種植物病害的防治[1-7]。有關(guān)金色產(chǎn)色鏈霉菌產(chǎn)多抗霉素的合成機(jī)理、多抗霉素合成基因簇、多抗霉素核苷骨架、金色產(chǎn)色鏈霉菌與其它鏈霉菌基因雜合產(chǎn)的次級代謝產(chǎn)物的研究，國內(nèi)外已有大量報道[7-13]，但目前對多抗霉素B的分析方法主要是生物效價測定法，該方法操作復(fù)雜，耗時長、準(zhǔn)確度低、精密度差，而且多抗霉素產(chǎn)品為多組分，生測法無法確認(rèn)是多抗霉素哪種組分，只能測出其生物活性，不適合用于生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制和市場監(jiān)督檢測。本文經(jīng)過多次試驗(yàn)，摸索出多抗霉素B的高效液相色譜法與質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法。該方法在國內(nèi)還未見報道，具有操作簡單快速、定量分析準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，易于推廣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金色產(chǎn)色鏈霉菌(S.aurea chromogemes,4896)由陜西麥可羅生物科技有限公司菌種中心保藏。

1.1.2 發(fā)酵設(shè)備與條件

三級發(fā)酵設(shè)備購置于南京天匯生物科技有限公司，零級發(fā)酵罐總體積為5L，一級發(fā)酵發(fā)酵罐體積為30L，三級發(fā)酵罐體積為50L。每個發(fā)酵罐安裝消毒的空氣導(dǎo)管，消毒空氣由小型空氣壓縮機(jī)產(chǎn)生并由導(dǎo)管輸入至發(fā)酵罐(裝有空氣流量計(jì))，消毒罐體的水蒸氣由蒸汽發(fā)生器產(chǎn)生并由導(dǎo)管輸入至發(fā)酵罐(中間裝有電磁閥、蒸汽計(jì)量計(jì))，每個發(fā)酵罐裝有實(shí)時監(jiān)控溶解氧、pH、溫度、轉(zhuǎn)速、補(bǔ)料、消泡和補(bǔ)酸堿系統(tǒng)。各級發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉為0.3%，葡萄糖為0.35%，酵母浸粉為0.35%，KH2PO4為0.15%，CaCO3為0.45%，豆粕0.45%，魚粉0.13%，NaCl為0.15%，豆油0.015%，(NH4)2SO4為0.1%，GPE消泡劑0.006%，淀粉酶0.0005%，余量為滅菌水。批次接種量為發(fā)酵體積的10%～15%，零級發(fā)酵時間為30h，一級發(fā)酵時間24h，二級發(fā)酵時間為110h。二級罐發(fā)酵110h后的發(fā)酵液經(jīng)12000rmp超速離心30min的上清液依次經(jīng)陶瓷膜過濾(膜平均孔徑0.1μm，跨膜壓0.2～0.3mPa),過濾液再次經(jīng)納濾膜過濾(截留分子量500以上的納濾膜)，截留液經(jīng)噴霧干燥塔制得多抗霉素粗粉。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

高效液相色譜儀：waters高效液相色譜儀；質(zhì)譜儀：Bruker 500MHz；玻璃器皿：50mL容量瓶；分析天平：梅特勒—托利多。

多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)品：自制，純度99.99%，將多抗霉素噴霧干燥的粗粉經(jīng)活性碳脫色、去蛋白、離子交換樹脂去離子后經(jīng)液相制備柱獲得多抗B純品；甲醇：色譜純；水：超純級；甲酸：分析純。

1.2 測試方法

1.2.1 液相色譜與質(zhì)譜試驗(yàn)條件

液相色譜柱：4.6mm×250mm，內(nèi)裝C18填料；流動相：(配置1‰甲酸水溶液)，V水+V甲醇=95%+5%；柱溫：35℃，進(jìn)樣體積：10μL；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：260nm，停留時間8.5min。質(zhì)譜測試：將10mg的多抗霉素標(biāo)準(zhǔn)品(樣品)N置于5mm核磁管中，加入0.50mL的D2O至管中，混合均勻后在Bruker500MHz設(shè)定好的條件下進(jìn)行測試。

1.2.2 多抗霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置

分別稱取多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)品約50mg至同一50mL容量瓶中，用水稀釋定容，然后分別用移液管取1mL至同一5mL容量瓶中，用水稀釋定容。

1.2.3 樣品溶液的配置

稱取含多抗霉素的樣品100mg至10mL容量瓶中，用水溶解并定容，用0.45μm濾膜過濾，備用。

1.2.4 定量分析

儀器達(dá)到平衡穩(wěn)定后，以下列序列的形式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液、兩針樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的定量分析，最終獲取多抗霉素BCN吸收峰的面積。

1.2.5 計(jì)算

多抗霉素原藥中多抗霉素B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω1(%)按式(1)計(jì)算：

(1)

式中，ω1為試樣中多抗霉素B質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以%表示；A2為試樣多抗霉素B峰面積；m1為標(biāo)樣的質(zhì)量，g；ω為標(biāo)樣中多抗霉素B質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以%表示；A1為試樣多抗霉素B峰面積；m2為試樣的質(zhì)量，g；N為稀釋因子，n=25。

2 結(jié)果與討論

2.1 多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜測試結(jié)果

稱取10mg的多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)品(樣品)置于5mm核磁管中，然后加入0.50mL的D2O至管中，混合均勻后在Bruker 500MHz設(shè)定好的條件下進(jìn)行測試。具體測試結(jié)果如圖1。

從圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)品中有效成分質(zhì)荷比為508，多抗霉素B的分子式為C17H25N5O13，CAS19396-06-6；多抗霉素B分子量為507，從而可以確認(rèn)制備所得樣品為多抗B樣品。

圖1 多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜測試結(jié)果

2.2 有效成分分析的系統(tǒng)一致性

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品B 699.6mg(編號A1)，至50mL容量瓶中，用超純水稀釋定容。然后單獨(dú)進(jìn)樣。

用移液管移取A1標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL于5mL容量瓶中，再用移液管移取2mL純水混合均勻，待用；A1稀釋3倍后連續(xù)6次進(jìn)樣測試，具體測試結(jié)果見表1。

從表1可知，多抗霉素B保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.79，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.94；證明系統(tǒng)一致性好。

2.3 線性響應(yīng)的測定

濃度1樣品：用移液管分別移取A1標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL于5mL容量瓶中，再加2mL純水，混合均勻，待用。將A1稀釋3倍的樣品標(biāo)號AD1；用移液管分別移取A1標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL于5mL容量瓶中，混合均勻，用純水定容，待用，將A1稀釋5倍的樣品標(biāo)號為AD2；用移液管分別移取A1標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于10mL容量瓶中，混合均勻，用純水定容，將A1稀釋10倍的樣品標(biāo)號為AD3；用移液管分別移取A1標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于25mL容量瓶中，混合均勻，將A1稀釋25倍的樣品標(biāo)號為AD4；用移液管分別移取A1標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL于50mL容量瓶中，混合均勻，將A1稀釋50倍的樣品標(biāo)號AD5。具體測試結(jié)果見表2和圖2。

表2 不同稀釋濃度的多抗霉素B高效液相測試結(jié)果

圖2 不同濃度的多抗霉素B與高效液相測試峰面積關(guān)系

從表2和圖2可知，多抗霉素B濃度與高效液相色譜測試的峰面積有很好的相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

2.4 精密度的測試結(jié)果

分別選擇有代表性的陜西麥可羅生物科技有限公司生產(chǎn)的3%多抗霉素可濕性粉劑和興農(nóng)16%多抗霉素可溶粒劑，同一樣品，重復(fù)測定幾次，按1.2的操作條件進(jìn)行測定，具體測定結(jié)果見表3。

從表3可知，陜西麥可羅3%多抗霉素可濕性粉劑中的多抗霉素B的變異系數(shù)為0.63%，興農(nóng)16%多抗霉素可溶性粒劑的多抗B的變異系數(shù)1.03，進(jìn)一步說明2種市場產(chǎn)品的多抗B的測定具有良好的精密度。由多抗霉素B高效液相測試圖3可知，兩者樣品的多抗B出峰時間為8.5min，在相同稱量值，兩者峰面積差別不大，進(jìn)一步說明陜西麥可羅3%多抗霉素可濕性粉劑與興農(nóng)16%的多抗霉素可溶性粒劑各自多抗B的含量占比差別不大。

表3 不同來源樣品的多抗霉素B高效液相測試結(jié)果

圖3 多抗霉素B的高效液相色譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了高效液相色譜法檢測多抗霉素制劑樣品有效成分的分析方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，此高效液相色譜法在測試范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法精密度準(zhǔn)確性良好，具有操作簡便、快速的特點(diǎn)，是產(chǎn)品質(zhì)量控制和應(yīng)用研究中較為理想的分析方法。