鄧?yán)罴t 張志鵬 田清清 程學(xué)仁 魯云 劉燎原

中圖分類號 R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）14-1739-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.14

摘 要 目的：建立吳茱萸和制吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，比較其相關(guān)性和差異性。方法：采用UPLC法。色譜柱為YMC Triart C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。以檸檬苦素為參照，繪制吳茱萸和制吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒（各10批，共60批）的特征圖譜，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評價，確定共有特征峰;采用方差分析評價共有特征峰峰面積占比的差異，并采用SPSS 20.0軟件對吳茱萸和制吳茱萸的飲片、水煎液、配方顆粒進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果：吳茱萸樣品和制吳茱萸樣品（飲片、水煎液和配方顆粒）的特征圖譜中分別均含有共有特征峰16、17個，指認(rèn)8、9、11、17號峰分別為檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和甘草酸;與飲片比較，水煎液和配方顆粒的特征峰相似度均低于0.55，而水煎液與配方顆粒特征峰的相似度均高于0.95。聚類分析和主成分分析結(jié)果顯示，吳茱萸飲片和制吳茱萸飲片聚為一類，吳茱萸水煎液、配方顆粒聚為一類，制吳茱萸水煎液、配方顆粒聚為一類。結(jié)論：制吳茱萸較吳茱萸增加了甘草酸，二者的飲片、水煎液、配方顆粒主要化學(xué)成分組成基本相同，但飲片與水煎液、配方顆粒成分的含量有所差異。

關(guān)鍵詞 吳茱萸;制吳茱萸;飲片;水煎液;配方顆粒;超高效液相色譜法;特征圖譜;化學(xué)模式識別

Study on UPLC Characteristic Chromatograms of Euodia rutaecarpa， Processed E. rutaecarpa Decoction Piece， Water Decoction and Formula Granules

DENG Lihong，ZHANG Zhipeng，TIAN Qingqing，CHENG Xueren，LU Yun，LIU Liaoyuan（Guangdong Yifang Pharmaceutical Co.， Ltd./Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule， Guangdong Foshan 528244， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish UPLC characteristic chromatograms of Euodia rutaecarpa， processed E. rutaecarpa decoction piece， water decoction and formula granules， and to compare its relationship and difference. METHODS： UPLC method was used. The determination was performed on YMC Triart C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid water solution （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 1 μL. Using limonin as reference， the characteristic chromatograms of E. rutaecarpa，processd E. rutaecarpa decoction piece， water decoction and formula granules （each 10 batches， totally 60 batches） were drawn. The similarity was evaluated with TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition）， and to determine the common characteristic peak. The differences of ratio of common characteristic peak area were evalucoted according to variance analysis.? Meanwhile， the cluster analysis and principal component analysis （PCA） were performed to research the differences of E. rutaecarpa， processed E. rutaecarpa decoction piece， water decoction and formula granules by using SPSS 20.0 software. RESULTS： Totally 16 and 17 common peaks were respectively confirmed in characteristic chromatograms of E. rutaecarpa samples and processed E. rutaecarpa samples （decoction piece， water decoction and formula granules）. No. 8， 9， 11， 17 peaks were identified as limonin， evodiamine， rutaecarpine and glycyrrhizic acid. Compared with decoction piece， the similarities of characteristic peak between water decoction and formula granules were lower than 0.55， while those between water decoction and formula granule were higher than 0.95. Cluster analysis and PCA results showed that E. rutaecarpa decoction piece and processed E. rutaecarpa decoction piece could be clustered into one category; E. rutaecarpa water decoction and formula granules could be clustered into one category; processed E. rutaecarpa water decoction and formula granules could be clustered into one category. CONCLUSIONS： Compared with E. rutaecarpa， processed E. rutaecarpa additionally contain glycyrrhizic acid; main chemical components of decoction piece， water decoction and formula granules are basically the same， but the contents of the components between decoction piece to water decoction and formula granules are different.

KEYWORDS? ?Euodia rutaecarpa; processed E. rutaecarpa; Decoction piece; Water decoction; Formula granules; UPLC; Characteristic chromatogram; Chemical pattern recognition

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸[Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.]、石虎[Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth. var. officinalis（Dode）Huang]或疏毛吳茱萸[Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth. var. bodinieri（Dode）Huang]的干燥近成熟果實，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，吳茱萸主要含有生物堿、檸檬苦素以及黃酮、酚酸、多糖、揮發(fā)油等多類成分，其中具有重要生物活性的生物堿類多為脂溶性成分，其極性較小，難溶于水[2-4]。吳茱萸生品性燥烈，有小毒，多以炮制品入藥，以達(dá)到減毒和降燥的目的[5-8]。中藥配方顆粒是單味中藥飲片經(jīng)過炮制、水提取、濃縮、干燥、制粒、包裝等生產(chǎn)工藝，加工制成的新型配方用中藥制劑。有研究表明，吳茱萸炮制后生物堿類、苦味素類等藥效成分含量及指紋圖譜均會發(fā)生不同程度的變化[9-11]，炮制前后飲片化學(xué)成分的變化及臨床煎煮提取率的不同均可能會影響吳茱萸的療效[12]。因此，探討吳茱萸配方顆粒制備過程中的化學(xué)成分轉(zhuǎn)化與藥效的關(guān)聯(lián)性，是保證吳茱萸臨床應(yīng)用安全、有效的切實可行的措施。目前，對吳茱萸飲片和配方顆粒指標(biāo)成分含量的相關(guān)質(zhì)量控制研究報道較多[13-15]，但關(guān)于吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒及其炮制品制吳茱萸的飲片、水煎液、配方顆粒間成分變化的相關(guān)性研究較少。本研究分別建立了吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒和制吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，比較了6種制劑間特征圖譜的相關(guān)性和差異性，旨在為吳茱萸炮制過程的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為保證吳茱萸與制吳茱萸相關(guān)制劑質(zhì)量的穩(wěn)定可控及其臨床使用的安全有效提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class型UPLC儀（美國Waters公司）;ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）;KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）;MiliQ Direct 8型超純水機(jī)（德國Merck公司）。

1.2 藥品與試劑

吳茱萸堿對照品（批號：110802-201710，純度：>99.6%）、吳茱萸次堿對照品（批號：110801-201608，純度：>99.7%）、檸檬苦素對照品（批號：110800-201707，純度：>97.9%）、甘草酸銨對照品（批號：110731- 201720，純度：>97.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院;吳茱萸配方顆粒（編號：K1～K10）和制吳茱萸配方顆粒（編號：K11～K20）均由廣東一方制藥有限公司提供（規(guī)格：每1 g配方顆粒相當(dāng)于飲片3 g）;甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

10批吳茱萸藥材（編號：1～10）由廣東一方制藥有限公司提供，并經(jīng)該公司魏梅主任藥師鑒定為蕓香科植物吳茱萸[E. rutaecarpa（Juss.）Benth.]的干燥近成熟果實。上述10批藥材主產(chǎn)于我國廣西壯族自治區(qū)、湖南省和江西省，其來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸飲片和制吳茱萸飲片的制備

取10批吳茱萸藥材，按照2015年版《中國藥典》（一部）吳茱萸項下飲片炮制方法[1]進(jìn)行炮制，分別制成10批吳茱萸飲片（編號：Y1～Y10）和10批制吳茱萸飲片（編號：Y11～Y20）;按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[16]中藥材煎煮方法相關(guān)要求，分別制備10批相應(yīng)的吳茱萸水煎液（編號：S1～S10）和制吳茱萸水煎液（編號：S11～S20），每1 000 mL水煎液由100 g飲片加水煎煮制得。

2.2 色譜條件

色譜柱：YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9 min，8%A;9～18 min，8%A→30%A;18～28 min，30%A→80%A;28～33 min，80%A→100%A）;流速：0.3 mL/min;檢測波長：254 nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：1 μL。

2.3 對照品溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液 分別取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素對照品適量，精密稱定，加乙腈-四氫呋喃混合溶液（25 ∶ 15，V/V）制成每1 mL中分別含吳茱萸堿30 μg、吳茱萸次堿10 μg、檸檬苦素50 μg的混合對照品溶液。

2.3.2 甘草酸對照品溶液 取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含甘草酸20 μg的對照品溶液（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7）。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 飲片供試品溶液 飲片經(jīng)粉碎后，取細(xì)粉約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，稱質(zhì)量后超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz）處理40 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 水煎液供試品溶液 精密量取水煎液5 mL，置于50 mL量瓶中，加水10 mL，再加甲醇定容，按“2.4.1”項下方法進(jìn)行超聲、補(bǔ)液、濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 配方顆粒供試品溶液 取配方顆粒適量，研細(xì)，取粉末約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，按“2.4.1”項下方法進(jìn)行超聲、補(bǔ)液、濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取“2.4.1”項下供試品溶液（編號：Y8）適量，按“2.2”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以保留時間適中且3種樣品中較穩(wěn)定的8號峰檸檬苦素為參照，計算得各特征峰相對保留時間（RRT）的RSD為0.02%～0.23%（n=6），相對峰面積（RPA）的RSD為0.16%～1.66%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.1”項下供試品溶液（編號：Y8）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以8號峰檸檬苦素為參照，計算得各特征峰RRT的RSD為0.01%～0.71%（n=6），RPA的RSD為0.24%～3.05%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗 精密稱取吳茱萸飲片樣品（編號：Y8），共6份，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以8號峰檸檬苦素為參照，計算得各特征峰RRT的RSD為0.01%～0.16%（n=6），RPA的RSD為0.15%～2.69%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 吳茱萸特征圖譜的建立與相似度、特征峰分析

2.6.1 吳茱萸特征圖譜的建立 按“2.4”項下方法分別制備10批吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒的供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，以編號Y1、S1、K1樣品的圖譜作為參照圖譜（R），生成特征圖譜，詳見圖1。結(jié)果，10批吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒的特征圖譜中，均含共有特征峰16個;與飲片比較，水煎液及配方顆粒中1～8號特征峰峰面積占特征峰總面積的比例（以下簡稱“峰面積占比”）均明顯增加，而9～16號特征峰的峰面積占比則有所下降。

2.6.2 相似度分析 在“2.6.1”基礎(chǔ)上，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對10批吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒特征圖譜中同一來源樣品進(jìn)行兩兩相似度分析。結(jié)果，與吳茱萸飲片比較，吳茱萸水煎液、配方顆粒特征圖譜中的16個特征峰均存在，但相似度均低于0.55，而吳茱萸水煎液與配方顆粒的相似度均高于0.95，表明吳茱萸飲片加水煎煮或制成配方顆粒后主要化學(xué)成分個數(shù)未發(fā)生變化，但其含量發(fā)生了明顯的變化;且吳茱萸配方顆粒與水煎液成分基本一致，這說明吳茱萸水煎液在濃縮、干燥、制粒過程中，其成分譜無明顯變化，詳見表2。

2.6.3 特征峰分析 取“2.3.1”項下混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖2。通過對比圖2與圖1，指認(rèn)出吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒UPLC特征圖譜中的8號峰為檸檬苦素、9號峰為吳茱萸堿、11號峰為吳茱萸次堿。

2.7 制吳茱萸特征圖譜的建立與相似度、特征峰分析

2.7.1 制吳茱萸特征圖譜的建立 按“2.6.1”項下方法，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，以編號Y11、S11、K11樣品的圖譜作為參照圖譜（R），生成特征圖譜，詳見圖3。結(jié)果，10批制吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒的特征圖譜中，均含共有特征峰17個;與飲片比較，水煎液及配方顆粒中1～8號特征峰的峰面積占比均明顯增加，而9～16號特征峰的峰面積占比均有所下降，17號特征峰的峰面積占比有增加趨勢。

2.7.2 相似度分析 在“2.7.1”基礎(chǔ)上，按“2.6.2”項下方法對10批制吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒特征圖譜中同一來源樣品進(jìn)行兩兩相似度分析。結(jié)果，與制吳茱萸飲片比較，制吳茱萸水煎液、配方顆粒特征圖譜中的17個特征峰均存在，但相似度均低于0.50，而制吳茱萸水煎液與配方顆粒的相似度均高于0.95，表明制吳茱萸飲片加水煎煮或制成配方顆粒后主要化學(xué)成分個數(shù)未發(fā)生變化，但其含量發(fā)生了明顯的變化;且制吳茱萸配方顆粒與水煎液成分基本一致，這說明制吳茱萸水煎液在濃縮、干燥、制粒過程中，其成分譜無明顯變化，詳見表3。

2.7.3 特征峰分析 取“2.3”項下混合對照品溶液和甘草酸對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖2、圖4。通過對比圖2、圖4與圖3，指認(rèn)出制吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒UPLC特征圖譜中的8號峰為檸檬苦素、9號峰為吳茱萸堿、11號峰為吳茱萸次堿、17號峰為甘草酸。

2.8 吳茱萸與制吳茱萸UPLC特征圖譜的相似度分析

比較同一來源的吳茱萸和制吳茱萸的特征圖譜，吳茱萸中有16個特征峰，制吳茱萸中有17個特征峰，后者新增的特征峰為17號峰甘草酸，其他特征峰為二者共有。排除17號峰，吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒與制吳茱萸飲片、水煎液、配方顆粒兩兩比較的相似度均高于0.9，詳見表4。這表明排除17號峰后，吳茱萸生品與炮制品的物質(zhì)基礎(chǔ)具有較高的相似性。

2.9 化學(xué)模式識別研究

2.9.1 方差分析 以10批吳茱萸、制吳茱萸的飲片、水煎液、配方顆粒共60個樣品的特征圖譜中16/17個特征峰峰面積占比作為變量（缺失特征峰峰面積記為0），使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5（檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。由表5可見，與吳茱萸飲片比較，吳茱萸水煎液和配方顆粒的16個特征峰均有顯著性差異（P<0.05）;與制吳茱萸飲片比較，制吳茱萸水煎液和配方顆粒的17個特征峰均有顯著性差異（P<0.05）。這說明吳茱萸和制吳茱萸飲片加水煎煮提取后化學(xué)成分間的比例關(guān)系發(fā)生了顯著的變化。與吳茱萸樣品比較，制吳茱萸樣品除增加17號特征峰甘草酸外，兩種飲片主要區(qū)別在于4、6～8、10、11、14、16號特征峰的峰面積占比，兩種水煎液主要區(qū)別在于1、2、4～7號特征峰的峰面積占比，兩種配方顆粒主要區(qū)別在于特征圖譜前半段水溶性成分1～8、11號特征峰的峰面積占比，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.9.2 聚類分析和主成分分析 將10批吳茱萸與制吳茱萸的飲片、水煎液、配方顆粒共60個樣品的特征圖譜中16/17個特征峰的相對峰面積作為變量（缺失特征峰峰面積記為0），使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析，結(jié)果見圖5、表6。

由圖5可見，吳茱萸飲片和制吳茱萸飲片可聚為Ⅰ類，其中吳茱萸飲片和制吳茱萸飲片又可分別聚為Ⅰa和Ⅰb類;吳茱萸和制吳茱萸的水煎液和配方顆?？删蹫棰蝾?，其中吳茱萸水煎液和制吳茱萸水煎液可聚為Ⅱa類、吳茱萸配方顆粒和制吳茱萸配方顆?？删蹫棰騜類。這表明炮制前后吳茱萸飲片和制吳茱萸飲片成分存在一定差異，但仍可聚為一類;飲片加水煎煮后提取出的成分變化較大，但其水煎液與配方顆粒之間無明顯差異，可聚為一類。

主成分分析結(jié)果以特征值大于1為判斷標(biāo)準(zhǔn)，提取出兩個主成分，主成分1（PC1）、主成分2（PC2）對總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)89.883%，說明這兩個主成分可作為樣品的主要評價指標(biāo)。根據(jù)主成分分析二維得分散點圖（見圖6）顯示，吳茱萸飲片、制吳茱萸飲片各聚為一類，與水煎液、配方顆粒樣品距離較大，表明飲片加水煎煮或制成配方顆粒后成分變化明顯;而吳茱萸水煎液與吳茱萸配方顆粒樣品距離較小，可聚為一類;制吳茱萸水煎液與制吳茱萸配方顆粒樣品距離較小，可聚為一類，表明水煎液與配方顆粒之間成分差異較小。

3 討論

供試品制備方法對特征圖譜的建立影響較大，本研究分別選取了不同比例的甲醇和乙醇作為提取溶劑。結(jié)果表明，當(dāng)選擇70%甲醇作為提取溶劑時，色譜峰的分離效果最好，響應(yīng)值較高，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。本研究同時考察了超聲和回流及不同提取時間對特征圖譜的影響。結(jié)果顯示，提取方法和提取時間對特征圖譜影響較小，故選擇超聲40 min為提取方法。

與吳茱萸/制吳茱萸飲片相比，其水煎液及配方顆粒特征圖譜中1～8號特征峰的峰面積占比明顯增加，而9～16號特征峰的峰面積占比有所下降，推測1～8號特征峰主要為水溶性黃酮苷類成分，易提取富集;9～16號特征峰主要為脂溶性生物堿類成分，煎煮提取率較低[10，17]。不同極性化學(xué)成分的生物活性存在差異，后續(xù)可對各個特征峰的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，對不同極性大小的化學(xué)成分進(jìn)行有效部位分離及生物活性研究。

吳茱萸和制吳茱萸的飲片、水煎液、配方顆粒對照特征圖譜對比結(jié)果顯示，制吳茱萸飲片增加了17號特征峰甘草酸，同時特征峰的增加也出現(xiàn)在制吳茱萸水煎液和配方顆粒中，這是因為制吳茱萸是用甘草煎湯進(jìn)行炮制，17號峰可能來源于甘草，此特征峰可用于鑒別吳茱萸和制吳茱萸。同時，4、6～8、10、11、14、16號特征峰的峰面積占比差異顯著也可作為吳茱萸飲片與制吳茱萸飲片的另一個區(qū)別要點。聚類分析和主成分分析結(jié)果顯示，吳茱萸飲片和制吳茱萸飲片雖有差異，但仍可聚為一類;吳茱萸水煎液、配方顆粒聚為一類，制吳茱萸水煎液、配方顆粒聚為一類。但炮制前后化學(xué)成分量變顯著是否是降低毒性或區(qū)別不同主治功能的原因，還有待進(jìn)一步藥理及臨床方面的研究予以驗證。

綜上所述，制吳茱萸較吳茱萸增加了甘草酸，二者的飲片、水煎液、配方顆粒主要化學(xué)成分組成基本相同，但飲片與水煎液、配方顆粒成分的含量有所差異。

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（收稿日期：2020-03-05 修回日期：2020-04-08）

（編輯：鄒麗娟）