張 敏，黃穎雪，李 瑋，鄭繼廣，何蘭蘭，王 令，王小波

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

隨著社會的發(fā)展，由于飲食節(jié)律、工作壓力、情志等原因，具有消化道疾病的人群越來越多，尤其以胃潰瘍疾病等最為常見。目前，在臨床上大多采用西藥聯(lián)合療法治療消化道疾病，如奧美拉唑、阿莫西林聯(lián)合克拉霉素三聯(lián)療法治療幽門螺桿菌胃潰瘍[1]，黛力新聯(lián)合三聯(lián)療法治療伴有焦慮抑郁癥消化性潰瘍等[2]，其治療作用較顯著，但其對人體的毒副作用較大。

苗藥加格略為百合科植物七葉一枝花ParispolyphyllaSmith的根莖，加格略又名重樓、七葉一枝花、燈臺七、獨角蓮，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，主要用于乳腺炎、胃潰瘍、胃出血、子宮頸糜爛等癥[3]?，F(xiàn)代研究表明，加格略具有抗胃潰瘍、鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤等藥理作用[6-11]。苗醫(yī)藥在治療胃潰瘍、胃出血癥時采用蒸制品。因此，本研究以胃粘膜損傷、IL-2、IL-6及TNF-α為檢測指標，比較蒸制前后加格略抗胃潰瘍的差異，挖掘出民族藥藥用價值，對加格略抗胃潰瘍機制及尋找和開發(fā)療效確切、毒副作用小的胃潰瘍藥物研究具有一定的意義。

1 材料

1.1 實驗動物

KM小鼠，SPF級108只，雌雄各半，體重18～20 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(湘)2014—0011。

1.2 實驗藥物及試劑

實驗藥材購自安順市寶林科技中藥飲片有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院魏升華教授鑒定為七葉一枝花ParispolyphyllaSmith的新鮮根莖。

鹽酸雷尼替丁膠囊(批號：07019030443，廠家：石藥控股集團河北永豐藥業(yè)有限公司)，購自花溪永康大藥房；IL-2 ELisa試劑盒(貨號GR-201907-01，武漢基因美科技有限公司)；IL-6ELisa試劑盒(貨號GR-201907-01，武漢基因美科技有限公司)，TNF-αELisa試劑盒(貨號GR-201907-01，武漢基因美科技有限公司)，均購自貴州博奧瑞杰生物科技有限公司。組織標本固定液(10%中性甲醛固定液)：多聚甲醛(批號：20180112，國藥集團化學試劑有限公司)，蘇木素染液(貨號：G1005-1，武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)，伊紅染液(貨號G1001，武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)，無水乙醇(分析純，批號：2018年05月30日，天津市富宇精細化工有限公司)。

1.3 實驗儀器

TGL-16M高速冷凍離心機(上海盧湘儀集團公司)，Bio-tek-ELx800酶標儀(上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司)。

2 實驗方法

2.1 藥液的制備

分別取加格略蒸品和生品極細粉，添加0.5%羧甲基纖維素鈉適量溶解，制成濃度分別為0.348 g/mL、0.174 g/mL、0.087 g/mL的藥液。取鹽酸雷尼替丁，加0.5%羧甲基纖維素鈉適量溶解，制成濃度為0.003 g/mL的藥液。

2.2 動物分組、給藥及模型的建立

SPF小鼠108只，于實驗室適應性飼養(yǎng)3天。將其隨機分為9組，每組12只，雌雄各半，分別為正常組、模型組、實驗藥物組、陽性藥物組。實驗藥物組分別以0.2 mL/10g灌胃加格略生品和蒸品藥粉高、中、低劑量組，正常組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉，陽性組灌胃等量鹽酸雷尼替丁膠囊藥液，連續(xù)給藥7天，每天1次。第7天給藥1 h后，除正常組外，均以1 mL/100g灌胃無水乙醇建立胃潰瘍模型。

2.3 檢測指標及方法

造模1 h后，對小鼠進行摘眼球取血，血清以4000 r/min 離心(離心半徑為7 cm)10 min，取上清液即為血清，按照ELisa試劑盒說明書測定IL-2、IL-6及TNF-α的濃度。小鼠脫頸處死，解剖小鼠，取各主要臟器進行稱重。切下全胃，擠出胃內(nèi)容物離心。將胃先注入冰生理鹽水將胃清洗干凈，沿胃大彎剪開胃組織，用肉眼和放大鏡觀察胃粘膜出血、潰瘍大小等狀況，采用游標卡尺測量潰瘍長、寬，計算胃潰瘍抑制率[胃潰瘍抑制百分率(%)=(模型組胃潰瘍指數(shù)-給藥組胃潰瘍指數(shù))/模型組胃潰瘍指數(shù)×100%，胃潰瘍指數(shù)(潰瘍面積)=潰瘍長×潰瘍寬。再將胃浸入4%的多聚甲醛組織固定液中固定48 h，固定完成后，根據(jù)HE染色方法對胃組織進行切片染色顯微鏡觀察。

2.4 統(tǒng)計分析

采用spss statistics 23.0統(tǒng)計計算軟件，以單因素方差分析比較各檢測指標是否具有顯著性差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 對潰瘍面積的影響

肉眼及顯微鏡觀察胃的組織情況，發(fā)現(xiàn)模型組具有明顯的點狀、線性及潰瘍面，空白組無明顯潰瘍，說明胃潰瘍模型建立成功。藥物組與模型組相比較，藥物組的潰瘍點數(shù)及面積明顯減少。

3.2 對胃黏膜病理學形態(tài)的影響

空白組胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃腺排列整齊，腺體底部多見主細胞，呈錐狀或柱狀，黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見血管和神經(jīng)，未見明顯增生。模型組黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃腺萎縮，局部胃腺壞死；固有層間質(zhì)內(nèi)出血，見紅細胞溢出血管散在分布，黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見炎細胞浸潤。陽性組黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃腺排列整齊，黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見少量炎細胞浸潤。生品低劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整，局部固有層內(nèi)少量胃腺壞死，黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見少量炎細胞浸潤。生品中劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層、肌層及外膜未見明顯炎細胞浸潤。生品高劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃腺排列較為整齊，胃腺細胞未見明顯變性壞死；黏膜下層、肌層及外膜未見明顯炎細胞浸潤。蒸品低劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整；黏膜層細胞排列較紊亂，部分胃腺細胞壞死，固有層及黏膜下層少量炎細胞散在浸潤。蒸品中劑量組，黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜層細胞排列較紊亂，固有層及黏膜下層少量炎細胞散在浸潤。蒸品高劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整；黏膜層細胞較紊亂，固有層及黏膜下層伴有少量炎細胞浸潤，黏膜下層、肌層及外膜未見明顯炎細胞浸潤。見圖1。

圖1 小鼠胃組織病理切片(HE×100)Fig.1 Pathological sections of the stomachs of mice(HE×100)

3.3 對胃潰瘍抑制率的影響

生品高中低劑量組對小鼠潰瘍平均抑制率分別為52.86%、25.89%、15.18%，蒸品高中低劑量的平均抑制率分別為48.21%、16.96%、12.33%，陽性的平均抑制率為27.6%。通過各藥物組生品與蒸制品相比較，結(jié)果表明，生品藥物組對潰瘍的抑制率較蒸品組高，見表1。

3.4 對小鼠IL-2、IL-6及TNF-α的影響

(1)對IL-2的影響：與模型組比較，空白組濃度降低，差異具有顯著性意義(P<0.05)，生品高、中劑量和蒸制品高劑量組IL-2顯著降低，具有極顯著差異(P<0.01)；與陽性組比較，生品高劑量組IL-2濃度降低，具有顯著性差異(P<0.05)。試驗結(jié)果說明生品高劑量組對IL-2具有較好的抑制率。

(2)對IL-6的影響：與模型組相比較，藥物生品和蒸制品高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)，且生品高劑量組IL-6的濃度小于蒸制品高劑量組，說明生品高劑量組較蒸品高劑量組對IL-6具有更好的抑制作用。

(3)對TNF-α的影響：與模型組比較，生品高、中劑量組，蒸品高劑量組均具有顯著性差異(P<0.05)，說明生品高、中劑量，蒸品高劑量對TNF-α均具有較好的抑制作用，且生品高劑量的效果更好；與陽性組相比較，生品高劑量組差異顯著(P<0.05)，說明生品高劑量對TNF-α的抑制作用較陽性藥物好。見表1。

表1 加格略藥材對乙醇致胃潰瘍各檢測因子的影響(n=12，x±s)Tab.1 Effects of Paris polyphylla on ethanol-induced gastric ulcer(n=12, x±s)

4 討論

胃潰瘍?yōu)榕R床常見的消化性疾病，其主要表現(xiàn)在胃粘膜組織的損傷、胃酸分泌增加、胃出血、炎性因子增加等。誘發(fā)胃潰瘍的原因主要有外部刺激、情志以及幽門螺旋桿菌感染等。

研究發(fā)現(xiàn)，陽性組，生品高、中、低劑量組，蒸品高、中、低劑量組等各藥物組動物胃組織病變程度均有不同程度減輕；各用藥組中，蒸品高劑量組和低劑量組動物胃組織病變相對較重，生品中、低劑量組和蒸品中劑量組病變程度相對較輕，生品高劑量組和陽性組基本正常。通過藥物組與空白組、模型組及陽性組之間IL-2、IL-6、TNF-α的比較，得出加格略生品與蒸制品對乙醇誘導的胃潰瘍炎性因子具有一定的抑制作用。

通過加格略生品與蒸制品抗胃潰瘍對比研究表明，加格略對無水乙醇胃潰瘍的抑制作用主要通過抑制潰瘍面積，改善胃黏膜組織損傷，降低IL-2和TNF-a的濃度，減輕胃腺壞死、胃出血及炎細胞浸潤等達到抗胃潰瘍的效果，其中生品對無水乙醇胃潰瘍作用較蒸品強。本研究可為加格略抗胃潰瘍機制研究奠定一定的基礎。