范亞莉，洪軍，殷青寧，周林平，巨巧云，馬紹青，王積川(青海省婦女兒童醫(yī)院急診科，西寧 810007)

外周血淋巴細(xì)胞亞群已成為評(píng)價(jià)人類免疫系統(tǒng)狀態(tài)的重要指標(biāo)[1]，許多疾病如感染、自身免疫性疾病和血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生均與淋巴細(xì)胞亞群有關(guān)，因此，建立健康人群外周血淋巴細(xì)胞亞群的參考區(qū)間尤其重要。研究表明，淋巴細(xì)胞亞群的參考區(qū)間受年齡、性別、民族和區(qū)域等因素影響[2]；另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，高原低氧環(huán)境可影響機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能[3]。然而，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的研究對(duì)象多集中于成年人，其年齡范圍相對(duì)狹窄。目前針對(duì)我國(guó)高海拔地區(qū)(>3 000 m)藏族健康兒童的免疫狀態(tài)評(píng)估尚未見報(bào)道。因此，本研究擬檢測(cè)青海玉樹地區(qū)755例藏族和174例漢族健康兒童淋巴細(xì)胞亞群的分布情況，并比較不同民族、不同性別和不同年齡之間的差異，以期為臨床診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年12月至2019年12月青海省婦女兒童醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康體檢且世居在海拔>3 000 m的青海玉樹地區(qū)的藏族兒童755例及漢族兒童174例，其中，藏族兒童中男458例，女297例，年齡(8.0±3.4)歲，學(xué)齡前組(3～6歲)439例，少年組(7～14歲)316例；漢族兒童中男81例，女93例，年齡(8.6±3.0)歲，學(xué)齡前組(3～6歲)76例，少年組(7～14歲)98例，兩組性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)、肝腎功能、X線檢查無(wú)異常；(2)無(wú)心、腦血管疾?。?3)無(wú)先天性免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾??；(4)無(wú)3周內(nèi)發(fā)生感染性疾病及急性時(shí)相反應(yīng)；(5)無(wú)HBV、HCB、HIV 和梅毒等慢性感染性疾??；(6)近期未使用過(guò)影響免疫系統(tǒng)的藥物。選取同期于青海省婦女兒童醫(yī)院體檢中心就診且世居玉樹地區(qū)的50例藏族健康成年人(19～60歲)，男25例，女25例，年齡(38±2.5)歲。本研究經(jīng)青海省婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn) (批準(zhǔn)文號(hào)：2017院倫審研第1號(hào))，健康成年人及患兒家屬均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 FACS cantoⅡ型流式細(xì)胞儀、淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒(MultiTestTMIMK Kit，貨號(hào)340503)、相同熒光素標(biāo)記的鼠抗同型對(duì)照IgG2a和溶血素(貨號(hào)349202)、四色熒光校準(zhǔn)微球均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群 無(wú)菌采集各研究對(duì)象清晨空腹靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，室溫靜置30 min。充分混勻后取50 μL抗凝血分別加入3個(gè)流式管(2管樣品管，1管同型對(duì)照)中，其中樣品管1中加入CD4FITC/CD8PE/CD45percp/CD3APC組合抗體20 μL，管2中加入CD3FITC/CD16+56PE/CD45percp/CD19APC組合抗體20 μL，同型對(duì)照管中加入相同熒光素標(biāo)記的的鼠抗同型對(duì)照IgG2a 20 μL，充分混勻，室溫避光溫育20 min，每管中加入1 000 μL溶血素，混勻后室溫避光靜置20 min；加入2 000 μL PBS，377×g離心5 min；棄上清，加入500 μL PBS重懸混勻后，2 h內(nèi)上機(jī)使用MuhiSET自動(dòng)分析軟件自動(dòng)獲取淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果，結(jié)果符合公式:T%+B%+NK%%±5%和Th%+Ts%=T%±5%即為可信。每次樣品檢測(cè)前使用專用四色熒光校準(zhǔn)微球進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，以保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，以(P2.5,P97.5)計(jì)算 95%參考值區(qū)間。兩組間比較采用Wilcxon秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同年齡兒童之間淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較 藏族健康兒童學(xué)齡前組和少年組之間比較，CD3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而B和NK細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；漢族健康兒童學(xué)齡前組和少年組之間比較，CD3+T、CD4+T和NK細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但CD8+T、B細(xì)胞和CD4+/CD8+之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藏族和漢族健康兒童總計(jì)之間比較結(jié)果表明，CD4+T、CD8+T細(xì)胞和CD4+/CD8+差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z分別為-3.114、-4.840和-4.582,P均<0.01)，但CD3+T、B和NK細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z分別為-0.198、-0.996和-4.453,P均>0.05)。見表1。

表1不同民族兒童外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果[M(P25,P75)]

2.2同民族不同性別兒童之間淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較 藏族健康兒童男性和女性之間比較，各檢測(cè)項(xiàng)目差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而漢族健康兒童男性和女性之間比較，各檢測(cè)項(xiàng)目差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2同民族不同性別兒童之間外周血淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果[M(P25,P75)]

2.3本研究建立的參考區(qū)間與其他地區(qū)比較結(jié)果 與國(guó)內(nèi)已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)比較，本研究建立的健康兒童淋巴細(xì)胞亞群參考區(qū)間存在較大的差異。見表3。

表3本研究與其他文獻(xiàn)報(bào)道的外周血淋巴細(xì)胞亞群參考區(qū)間的對(duì)比

3 討論

T淋巴細(xì)胞亞群分析是評(píng)估免疫功能的重要指標(biāo)，一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果表明，外周血淋巴細(xì)胞亞群分布受地域、種族、年齡和性別影響[8]。本研究中不同年齡之間比較結(jié)果表明，藏族學(xué)齡前組和少年組之間B和NK細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；漢族學(xué)齡前組和少年組之間CD8+T、B細(xì)胞和CD4+/CD8+差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明年齡是造成部分淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)差異的重要因素，這與王文第等[5]和林珊等[6]報(bào)道的結(jié)果相似，分析原因可能與發(fā)育過(guò)程中受到更多暴露抗原刺激，免疫系統(tǒng)逐漸成熟而導(dǎo)致分布不同有關(guān)。本研究中藏族健康兒童各年齡段的所有淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)均有性別的差異，其中男性CD3+T和CD8+T細(xì)胞高于女性，B細(xì)胞低于女性，其余指標(biāo)分布特點(diǎn)和王永順等[8]研究結(jié)果一致。王文第等[5]、林姍等[6]和肖婧等[7]研究結(jié)果表明，漢族健康兒童T、CD4+T、B和NK細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但張志平等[9]研究結(jié)果表明，漢族健康兒童男女性別間T、CD4+T、CD8+T、B和NK細(xì)胞的百分率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果中漢族健康兒童各年齡段的所有淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)均無(wú)性別差異(P>0.05)，與張志平等[9]的研究結(jié)果相一致，而與王文第等[5]、林姍等[6]和肖婧等[7]研究結(jié)果明顯不同。由此可見，高海拔地區(qū)藏族成年人和兒童男女之間淋巴細(xì)胞亞群分布特點(diǎn)存在差異，與高海拔地區(qū)漢族亦有不同的分布特點(diǎn)，這可能是由于不同民族男女在高海拔環(huán)境下機(jī)體對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)不同。周晶萍等[3]對(duì)海拔 4 500 m地區(qū)健康成年人T 細(xì)胞亞群進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)藏族人群CD4+T和CD8+T細(xì)胞雖然高于漢族人群，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而藏族人群NK細(xì)胞明顯低于漢族人群；B細(xì)胞明顯高于漢族人群(P<0.05)。本研究結(jié)果表明，藏族和漢族兒童僅CD4+T和CD8+T差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藏族CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平低于漢族， CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平高于漢族(P<0.05)，表明同一海拔下健康成年人和兒童具有不同的民族差異特點(diǎn)，這可能提示不同民族和年齡適應(yīng)高原低氧環(huán)境產(chǎn)生的生理性改變，免疫系統(tǒng)會(huì)做出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。此外，本研究結(jié)果與全國(guó)其他地區(qū)相比，總體上均存在一定差異，這可能與樣本量、地理環(huán)境與生活習(xí)慣相關(guān)，也可能與檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)方法的不同相關(guān)，臨床實(shí)驗(yàn)室若直接沿用診斷試劑公司提供的參考區(qū)間，也會(huì)造成一定誤差，所以建立本地的參考區(qū)間顯得十分必要。

本研究成功建立了青海玉樹地區(qū)藏族和漢族健康兒童淋巴細(xì)胞亞群的參考區(qū)間，對(duì)相關(guān)疾病的診斷分期、治療評(píng)價(jià)、和預(yù)后判斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但由于本研究樣本只選取了青海玉樹地區(qū)的健康兒童作為研究對(duì)象，且年齡分布相對(duì)集中，漢族兒童男女例數(shù)小于100例，所得到的參考區(qū)間還需要在更大樣本量及多地區(qū)的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。