劉念 蒙大慶 祝捷

摘要：綿陽市農業(yè)科學研究院于1993年發(fā)現(xiàn)了油菜（Brassica napus L.）核三系保持系新材料綿7MB，在其自交以及兄妹交后代分離群體中，育性分離比例均不符合孟德爾遺傳規(guī)律，呈現(xiàn)出偏分離現(xiàn)象。通過對綿7MB田間遺傳分析和細胞學分析，對其遺傳機理進行了初步的探索。結果表明，偏分離現(xiàn)象可能是由于綿7MB在雄配子傳遞過程中引起的。綿7MB偏分離現(xiàn)象的產生不是由于減數(shù)分裂異常，可能由于部分基因型的合子死亡，導致后代比例出現(xiàn)異常。

關鍵詞：甘藍型油菜（Brassica napus L.）;偏分離;雄性不育;綿7MB

中圖分類號：S565.4 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）10-0019-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.004 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The new nuclear three-lines maintainer Mian 7MB was revealed by Mianyang Academy of Agricultural Sciences in 1993. In the segregating population of selfing and sibling offspring， the proportion of fertility segregation did not conform to Mendelian genetic law， showing a partial segregation phenomenon. Through the field genetic analysis and cytological analysis， the genetic mechanism of Mian 7MB was preliminarily explored. The results showed that the segregation distortion in Mian 7MB only happened in the male gamete transference. Mian 7MB segregation was not due to abnormal meiosis， but may be due to the death of zygotes of some genotypes， resulting in abnormal proportion of offspring.

Key words： Brassica napus L.; segregation distortion; male sterility; Mian 7MB

油菜（Brassica napus L.）是世界上四大油料作物之一。中國油菜播種的總面積和總產量都位于世界首位，約占世界的30%[1]。油菜具有雜種優(yōu)勢強、繁殖系數(shù)高、雜種制種技術簡單等特點，因此在油菜上利用雜種優(yōu)勢具有重要的理論和實踐意義[2]。目前，中國研究和利用雜種優(yōu)勢的主要途徑有細胞質雄性不育、細胞核雄性不育、細胞核+細胞質雄性不育、生態(tài)型雄性不育、化學殺雄處理、自交不親和、天然雜交等方法。在油菜雜種優(yōu)勢利用途徑中，細胞核雄性不育具有不育性徹底、穩(wěn)定，恢復源廣，育種周期短，而且不受細胞質不育中恢-保關系的限制，不存在不育胞質的負效應和細胞質單一的風險，容易獲得強優(yōu)勢的雜交組合。但是細胞核雄性不育很難獲得100%的全不育群體，在繁殖和制種時必須用人工拔除不育系中50%的可育株，嚴重影響油菜種子生產的成本和質量[3]。如何在母本中經濟有效地去除50%的可育株，是細胞核雄性不育可以廣泛應用的瓶頸問題，也是世界各國油菜研究單位試圖解決的問題。

綿陽市農業(yè)科學研究院于1993年起，在自育ms1、ms2類型隱性核兩系不育材料轉育過程中，發(fā)現(xiàn)了綿7MB這一雄性不育保持系，于1998年選育出較好的保持系綿7MB-1[4]。該材料與不育單株的雜交后代中，可以獲得80%～90%的不育群體，綿7MB自交后代中不育株的比例可以達到50%～60%，不育株在不同的測交組合和自交后代群體中的比例明顯高于1對等位基因的分離比例，不符合孟德爾遺傳學規(guī)律。本研究通過對綿7MB田間遺傳和細胞學分析，分析其育性控制基因及其在后代群體中的分布特點，并結合細胞學觀察對綿7MB材料的遺傳機理進行了初步探索，以期為這方面研究提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

甘藍型油菜雄性不育兩型系材料不育株綿7MA和可育株綿7MB由綿陽市農業(yè)科學研究院選育和提供。綿7MB自交后代中有少量單株的自交后代育性比例恢復到3∶1的情況，將這種后代育性比例恢復正常的可育株稱作綿7MB*。

1.2 ?方法

1.2.1 ?田間育性調查 ? 2014—2016年連續(xù)3年對綿7MA×S45B、綿7MB（人工去雄）×S45B、S45A×綿7MB、S45B×綿7MB 4個雜交組合F1代進行田間育性調查，進一步驗證綿7MB與S45育性控制基因的遺傳等位性。同時對綿7MB自交后代和綿7MA×綿7MB兄妹交后代群體進行育性調查，分析綿7MB育性偏分離現(xiàn)象的一般規(guī)律。

1.2.2 ?花粉活性觀察 ? ?采用醋酸洋紅染色法鑒定花粉育性，于油菜盛花期，上午8：00—10：00采集不同單株上、中、下不同位置即將開放的新鮮花蕾（3～5個），做好標記，用消毒的鑷子將花藥上的花粉粒置于載玻片上，用解剖針搗碎，加1～2滴醋酸洋紅溶液染色，蓋上蓋玻片，用吸水紙將其周圍多余的液體吸干，輕輕壓片，置于顯微鏡下觀察。根據(jù)花粉染色情況及形態(tài)判斷其育性：圓形飽滿且深紅色的花粉粒表示其具有高生活力;低生活力或者不育的花粉粒表現(xiàn)為形態(tài)不規(guī)則、外形干癟、畸形而且染色后不能著色或著色較淺。

1.2.3 ?花藥減數(shù)分裂的細胞學觀察

1）材料準備。在油菜現(xiàn)蕾之后，花蕾直徑為2～3 mm的時候，取整個花序。將材料置于卡諾固定液（乙醇、冰醋酸體積比為3∶1）中固定。隔3～4 h后換新鮮的卡諾固定液，換4～5次（卡諾固定液不再變黃為止），可4 ℃長期保存以備觀察。

2）制片及觀察。取出油菜花蕾，用去離子水漂洗1～2次。用解剖針或者尖頭鑷子將花蕾剝開，將花藥取出置于1 mol/L HCl中60 ℃水浴2 min，取出后用去離子水浸泡1 min。將材料置于干凈的載玻片上，用解剖針或鑷子將其搗碎。加1滴卡寶品紅染色液染色30 s，然后用解剖針將搗碎的材料均勻涂開，取干凈的蓋玻片蓋上，用濾紙包住蓋片，先用手指輕輕擠壓蓋片去除多余的染色液，然后用吸水紙將其周圍多余的液體吸干。將玻片固定于顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.4 ?胚發(fā)育觀察 ?分別選取綿7MB自交偏分離群體中植株生長發(fā)育狀況基本一致的單株，人工套袋授粉，于授粉后7、14、21、28 d后取主花序相同部位的角果，從中間剖開觀察。

2 ?結果與分析

2.1 ?田間育性調查分析

對綿7MB自交群體和兄妹交群體后代可育株和不育株育性以及花器官形態(tài)進行田間調查，發(fā)現(xiàn)綿7MB可育株開花期要比綿7MA早5 d左右;可育株花蕾較大，花絲較長，花藥飽滿，花粉量充足;不育株花蕾空癟，雄蕊花絲較短，花藥在花蕾盛開前就已經退化萎縮，敗育徹底，無微粉現(xiàn)象。

連續(xù)對綿7MB自交、綿7MB兄妹交、綿7MA×S45B、綿7MB（人工去雄）×S45B、 S45A×綿7MB、S45B×綿7MB，這些雜交組合的F1代進行育性調查統(tǒng)計。從表1可以看出，綿7MA×S45B、綿7MB（人工去雄）×S45B雜交F1代比例為1∶1和3∶1，符合孟德爾遺傳規(guī)律，與蒙大慶等[5]的研究結果一致。田間調查結果表明，綿7MB的育性控制基因與S45的育性控制基因可能是由相同的等位基因控制。綿7MB自交、綿7MB兄妹交、S45A×綿7MB、S45B×綿7MB雜交F1代不育率較高，不符合孟德爾遺傳學比例，育性遺傳呈現(xiàn)出偏分離現(xiàn)象（表2）。

當綿7MB作為母本時，雜交組合后代均沒有偏分離現(xiàn)象發(fā)生;而當綿7MB作為父本時，后代群體中就會發(fā)生育性偏分離現(xiàn)象。推測偏分離現(xiàn)象可能是由于綿7MB在雄配子傳遞過程中引起的。

2.2 ?花粉活性觀察

對偏分離材料綿7MB可育株花粉粒進行染色，從圖1可以看出，綿7MB與正常植株花粉粒相比，無明顯差異，均表現(xiàn)為花粉粒著色較深，花粉粒圓形且飽滿。花粉活性檢測說明，綿7MB偏分離現(xiàn)象并不是由于部分花粉活性異常引起的。

2.3 ?減數(shù)分裂細胞學觀察

對綿7MB雄蕊花藥進行減數(shù)分裂觀察，發(fā)現(xiàn)綿7MB減數(shù)分裂中同源染色體聯(lián)會、分離均表現(xiàn)正常（圖2），減數(shù)分裂過程中無異常出現(xiàn)。說明綿7MB育性偏分離現(xiàn)象的產生不是由于減數(shù)分裂異常引起的。

2.4 ?胚發(fā)育觀察

從圖3可以看出，綿7MB所結角果有明顯的死胚現(xiàn)象出現(xiàn)。在受精后14 d，綿7MB角果中部分合子發(fā)育明顯緩慢;至受精后21 d，生長緩慢的合子開始脫水萎縮;受精28 d后徹底干癟死亡。統(tǒng)計偏分離材料綿7MB的死胚率發(fā)現(xiàn)，與對照相比，綿7MB角果中死胚率較高（表3）。說明胚致死現(xiàn)象可能是導致綿7MB偏分離現(xiàn)象產生的原因之一。

3 ?討論

偏分離現(xiàn)象是指在分離群體后代中，某一基因頻率或者基因型頻率明顯偏離經典遺傳學比例的現(xiàn)象[6]。偏分離現(xiàn)象的實質是一種選擇的過程，包括對配子、合子生活力以及競爭力的選擇。偏分離現(xiàn)象作為一種普遍存在的遺傳學現(xiàn)象，在小鼠[7]、果蠅[8]、水稻[9]、玉米[10]、小麥[11]等植物中均有發(fā)現(xiàn)。但是由于物種來源、遺傳作用方式等因素的不同，對偏分離現(xiàn)象的遺傳機理研究有待深入。新型核不育保持系綿7MB也呈現(xiàn)出偏分離現(xiàn)象。本研究通過對綿7MB田間遺傳進行分析，表明偏分離現(xiàn)象可能是由于綿7MB雄配子傳遞過程中引起的。對綿7MB細胞學進行分析，表明綿7MB偏分離現(xiàn)象的產生不是由于減數(shù)分裂異常，可能由于部分基因型的胚死亡導致后代比例出現(xiàn)異常。對于出現(xiàn)這種偏分離的分子作用機理，還需要進一步研究。

參考文獻：

[1] 劉后利.實用油菜栽培學[M].上海：上海科學技術出版社，1987.

[2] 傅廷棟.雜交油菜的育種與利用[M].武漢：湖北科學技術出版社，1995.

[3] 侯國佐.油菜隱性核不育研究與利用[M].北京：科學技術文獻出版社，2008.

[4] 蒙大慶，袁代斌，劉 ?念，等.甘藍型油菜核三系育種研究與應用[J].技術應用，2012，9（71）：51-54.

[5] 蒙大慶，袁代斌，郭子榮，等.雙低甘藍型油菜新型核不育系綿7AB-4的遺傳研究Ⅰ.育性表現(xiàn)的初步研究[J].四川農業(yè)大學學報，2005，23（1）：24-27.

[6] 劉海燕，崔金騰，高用明.遺傳群體偏分離研究進展[J].植物遺傳資源學報，2009，10（4）：613-617.

[7] CASELLAS J，F(xiàn)ARBER C R，VERDUGO R A，et al. Segregation analysis of a sex ratio distortion locus in congenic mice[J].J Hered，2010，101：351-359.

[8] MONTCHAMP C M，GINHOUX V，ATLAN A.The Y chromosomes of Drosophil simulansare highly polymorphic fortheir ability to suppress sex-ratio drive[J].Evolution，2001，55：728-737.

[9] REFLINUR，KIM B，JANG S M，et al.Analysis of segregation distortion and its relationship to hybrid barriers in rice[J].Rice，2014，7：3.

[10] WANG G，HE Q Q，XU Z K，et al. High segregation distortion in maize B73C × teosinte crosses[J].Genet Mol Res，2012，11：693-706.

[11] TAKUMI S，MOTOMURA Y，IEHISA J C，et al. Segregation distortion caused by weak hybrid necrosis in recombinant inbred lines of common wheat[J].Genetica，2013，141：463-470.