陳興龍，謝錦芳，巫 彬，馮曉敏，黃詠虹，高小寧，劉 睿，吳嘉云，陳駿佳，齊永文*

(1廣東省科學院生物工程研究所，廣東廣州510316；2仲愷農業(yè)工程學院農業(yè)與生物工程學院，廣東廣州510225)

0 前言

甘蔗(Saccharum spp.)是我國最主要的糖料作物，種植面積約為 110.85萬 hm2[1]。ROC22在 20多年來一直是我國主導品種，種植面積最大，2014～2019年累計種植面積達315.60萬hm2[1]。該品種為臺灣甘蔗研究所育成，母本為ROC5，父本為69-463，該品種的特征特性為：中莖至大莖，且蔗莖均勻，莖皮遮光部分淺黃綠色，露光部分紫紅色，芽呈卵圓形。57號毛群較發(fā)達，萌芽良好，分蘗力強，初期生長稍慢，中后期生長快速，原料蔗莖長，莖數(shù)中等，易脫葉，甘蔗基部粗大，不易倒伏，耐旱力強，抗褐銹病(含Bru1基因)等[2-3]。近幾年因宿根性差、不適宜機械化、感黑穗病等因素，種植面積逐步減少[1]。利用國外引進的品種為雜交親本選配組合，是拓寬甘蔗育種的遺傳基礎、促進品種改良的重要途徑。CP84-1198是由美國農業(yè)部運河點甘蔗育種場育成，因為宿根性好，高糖等優(yōu)點，受到我國育種家的高度關注。為了更好的改良ROC22，本研究以ROC22為父本，CP84-1198為母本配制雜交組合，期望找到性狀優(yōu)良的雜交后代。

由黑頂柄銹菌(Puccinia melanocephalaH.Sydow & P. Sydow)引起的甘蔗褐銹病是甘蔗上產上重要的葉部病害，可引起嚴重的產量和糖分損失[4]。目前，該病害在爪哇、古巴、牙買加、美國、澳大利亞、墨西哥、泰國、毛里求斯、中國等甘蔗種植國家和地區(qū)都有發(fā)生，已經發(fā)展成為一種世界性的甘蔗病害[5]。培育抗銹病的品種是防治該病害最為經濟有效的方法。Asnaghi等[6]在甘蔗栽培種 R570上發(fā)現(xiàn)了一個對世界各個地區(qū)的褐銹病柄銹菌都具有廣譜抗性主效抗性基因Bru1。Costet等[8]通過對R570抗褐銹病遺傳機制的系列研究，開發(fā)出了2個與該基因緊密連鎖的分子標記R12H16和9O20-F4。此后這2個標記被廣泛應用于甘蔗褐銹病的抗病育種研究當中，特別是對甘蔗核心親本和其他重要科研材料的篩選[6-9]。而對于雜交后代分離群體抗褐銹病基因個體的遴選鮮有報道。在選育實生苗階段對雜交群體進行目標基因的檢測，有利于實現(xiàn)早代選擇，大幅度提高育種效率，降低育種成本，提升育種進程。

R12H16和 9O20-F4在甘蔗褐銹病抗性分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)中具有重要作用。Costet等[8]用這2個標記對380份甘蔗材料進行Bru1基因的檢測，發(fā)現(xiàn)這2個標記完全相關。李文鳳等[9]通過對 101份主要育種親本進行分子檢測，2個分子標記重復檢測結果一致。端木卜文等[10]通過對164份國內外甘蔗種質材料進行Bru1基因的檢測，也發(fā)現(xiàn)這2個分子標記檢測到的結果完全一樣。因此，本研究選取其中的標記 R12H16對CP84-1198×ROC22雜交群體進行Bru1基因分子檢測，分析雜交后代群體中Bru1基因的分布，為后續(xù)抗甘蔗褐銹病的研究提供材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

母本：CP84-1198，父本：ROC22，父母本的花穗雜交授粉委托廣東省科學院生物工程研究所海南甘蔗育種場進行，1100個雜交后代實生苗種植于廣東省科學院生物工程研究所的韶關市翁源基地。田間管理與常規(guī)生產操作一致。

R570：已知含有甘蔗褐銹病抗性基因Bru1，保育在本課題組的資源圃。

主要儀器：Vortex Shaker振蕩器(QL-861，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；BioPhotometer 核酸蛋白測定儀(D30，德國艾本德股份公司)；PCR儀(TC-XP，杭州博日科技有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+，美國伯樂公司)。

主要試劑：CTAB (Hexadecyltrimethylammon--ium Bromide)、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、Pro Taq預混液、瓊脂糖凝膠、核酸染料GoldView。

1.2 甘蔗基因組DNA提取

隨機挑取 280個株系苗期的新鮮嫩葉，采用CTAB的方法提取甘蔗基因組DNA。具體步驟如：稱取1 g的嫩葉剪碎放于研缽中，用液氮研磨至粉末，裝入 2 mL離心管中，并加入 650 μL的 2×CTAB；混勻后置于65℃水浴鍋45 min，每隔15 min上下顛倒混勻一次；待管內溶液降至室溫后加入650μL的氯仿∶異戊醇(24∶1)，儀器劇烈混勻，10000 r/min 離心10 min；取600 μL上清液于新的離心管中，加入600 μL的氯仿∶異戊醇(24∶1)，儀器劇烈混勻，10000 r/min離心10 min；取500 μL上清液于新的離心管中，加入1000 μL的異丙醇，上下顛倒混勻，可以觀察到棉絮狀 DNA，放置-20℃下沉淀30 min以上；10000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用500 μL 75%乙醇洗滌2遍，離心5 min，風機抽干10 min；溶解于100 μL TE緩沖液或者無菌水中，于分光光度計下測量 DNA濃度并記錄，用TE緩沖液或ddH2O稀釋至所要的濃度或保存于-20℃冰箱。

1.3 引物的合成

參照梅志鵬等[11]的引物，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司廣州合成部合成，引物R12H16擴增 570 bp片段：Forward：5’-CTACGATGAAACTACACCCTTGTC-3’，Reverse：5’-CTTATGTTAGCGTGACCTATGGTC-3’。

1.4 PCR擴增

以品種 R570為陽性對照，提取的 280份CP84-1198×ROC22雜交群體各個株系的DNA為反應體系的模板，用R12H16引物進行PCR擴增。擴增反應總體系為20 μL PCR反應體系：ddH2O，6.5μL；Primer各 0.5 μL；2×Pro Taq 預混液 10 μL；DNA 2.5 μL。PCR反應程序為：95℃預變性10 min，94℃變性35 s，56℃退火35 s，72℃延伸40 s，36個循環(huán)，延伸72℃ 10 min，4℃保存。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳

將R12H16標記PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測：先把 1.5%瓊脂糖凝膠(1×TE)煮沸溶解(80 mL TE+5 μL GoldView)，冷卻到 65℃左右導入插好梳子的制膠槽，混勻 10 μL PCR產物(已含染料)，加入瓊脂糖凝膠孔上，80 V電壓下，由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動，當產物跑到邊緣1 cm之前停止電泳，在紫外燈下觀察，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.6 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)孟德爾分離定律，只有當 ROC22的Bru1位點上含有單個抗性等位基因，另一個親本CP84-1198的Bru1位點上不含有抗性等位基因，其雜交F1后代才會出現(xiàn)1∶1的分離比，類似于2倍體中的測交試驗。如果ROC22的Bru1位點上含有2個抗性等位基因，跟不含 Bru1抗性基因的CP84-1198雜交 F1后代就會出現(xiàn) 2(抗)∶1(感)的分離比，以此類推。

卡方檢驗：假設CP84-1198×ROC22雜交群體中含有和不含有抗銹病Bru1基因個體分離符合1∶1 的比率，水平 α=0.05 (χ2=3.84)，自由度df=k-1=1(k=2)，含有抗銹病Bru1基因的理論個體數(shù)為：Ei=280×1/2=140，不含有抗銹病 Bru1基因的理論個體數(shù)為：Ei=280×1/2=140。

2 結果與分析

2.1 甘蔗CP84-1198×ROC22雜交群體構建

以CP84-1198為母本，為ROC22父本，委托廣東省科學院生物工程研究所海南甘蔗育種場進行父母本的花穗雜交授粉，獲得1100個雜交后代，經由本實驗室溫室育苗并把實生苗移栽種植到廣東省韶關市翁源基地(見圖1)。

2.2 甘蔗 CP84-1198×ROC22雜交群體銹病抗性基因Bru1檢測

圖1 甘蔗CP84-1198×ROC22雜交群體田間圖

從1100個雜交后代的實生苗中挑取280個株系組成一個分離群體。并對該群體進行銹病抗性基因Bru1的PCR檢測。以R12H16標記引物對280個株系的DNA進行PCR擴增，部分結果如圖2所示，泳道0是陰性對照，未能擴增出條帶，泳道R代表的R570和泳道R2代表的親本ROC22在570 bp處都能夠穩(wěn)定擴增出一條特異性的目標條帶，而泳道CP所代表的親本CP84-1198則不能擴增出條帶，泳道 6、7、13、22、35、66、74、83、90分別代表該群體編號為 6、7、13、22、35、66、74、83、90的樣品，也能夠擴增出清晰的條帶。挑選泳道6、7、22、35、83、90個樣本的擴增產物進行單向測序，測序比對結果如如圖3所示，除了引物開頭(紅色大框內)和結尾為570 bp處(紅色小框內)沒有全部比對上，其余堿基與R570和ROC22的Bru1(R12H16標記)堿基序列完全一致，表明含有 Bru1基因。圖中條帶顏色越深表示Bru1基因擴增產物含量越高，顏色越淺表示含量越低。而泳道12、20、21、36、55、56、67、75、82、91、94分別代表該群體編號為12、20、21、36、55、56、67、75、82、91、94 的樣品，都未能夠擴增出特異條帶，表示不含有Bru1基因。

圖2 R12H16標記對CP84-1198×ROC22雜交群體樣本褐銹病抗性基因Bru1的PCR擴增電泳圖

圖3 R12H16標記擴增序列比對結果

雜交群體中其它株系的擴增結果如表1所示，共有156個株系擴增出570 bp目標條帶(陽性)，表明這些株系含Bru1基因，占供試材料的 55.71%，其余 124個株系均未能擴增出目標條帶(陰性)，表明不含有Bru1基因，占供試材料的 44.29%。含有與不含有抗銹病Bru1基因的比例近似于 1∶1，卡方值χ2=3.43，小于3.84(自由度df=1時，P=0.05)，符合理論比，表明親本ROC22含有單個抗銹病Bru1等位基因，而親本CP84-1198不含有抗銹病Bru1等位基因。

表1 CP84-1198×ROC22雜交群體抗甘蔗褐銹病Bru1基因的PCR檢測結果

3 討論

在過去的20多年里ROC22是我國種植面積最大的品種，占據(jù)絕對的主導地位，但是近幾年來因宿根性差、不適宜機械化、感病等因素，種植面積逐步減少[1]。CP84-1198具有宿根性好、高糖、抗病性好等優(yōu)點，據(jù)此，本研究配制CP84-1198×ROC22雜交組合，分析雜交后代中褐銹病基因的分離，對于以 ROC22為基礎進行品種改良以及新品系創(chuàng)制具有重要的意義。

甘蔗褐銹病已經慢慢成為了一種世界性的甘蔗病害[5]。而主效抗性基因Bru1對褐銹病柄銹菌具有廣譜抗性，因此Bru1基因在甘蔗褐銹病的抗病育種中具有舉足輕重的作用[7]。Costet等[8]開發(fā)的2個與Bru1基因緊密連鎖的標記，大大加速了抗性基因的檢測技術，并且運用到實際生產當中，如對甘蔗核心親本和其他重要科研材料的檢測[7,9]。本研究通過對CP84-1198×ROC22群體Bru1基因的檢測也證實了該基因的分子標記輔助選擇(MAS)可以運用雜交后代的快速選擇。測序結果與 Wang等[12]的比對當中，由于本文只選擇了單向測序所以在上游引物之后的堿基剛開始往往測的不是非常準確，難免有幾個比對不上的堿基，測序結尾部分由于 Wang等的只測序了569 bp，而本文測序到570 bp，所以會多出一個堿基。本群體的親本ROC22含有Bru1基因，而親本CP84-1198不含有Bru1基因的結果與傅華英等[3]和李文鳳等[9]的結果一致。CP84-1198×ROC22分離群體的檢測結果中發(fā)現(xiàn)，雜交后代中含有與不含有抗銹病基因 Bru1符合理論比 1∶1，進一步驗證親本ROC22含有單個抗銹病Bru1等位基因，而親本CP84-1198不含有抗銹病Bru1等位基因，對甘蔗褐銹病抗基因的遺傳機制研究具有重要意義。此外，明確CP84-1198×ROC22雜交群體中各個株系抗甘蔗銹病Bru1基因的分布情況，可以為深入開展該群體抗褐銹病育種、選育和推廣優(yōu)良抗性品系提供材料基礎。這也為利用分子標記輔助選擇(MAS)抗病育種提供了有力的證據(jù)，在實生苗階段通過選育具有目標基因的株系，能夠在大量的甘蔗種質資源后代材料中快速、高效、準確地篩選抗病材料，實現(xiàn)早代選擇，縮短抗病育種時間，大幅度提高育種效率，降低育種成本，加快育種進程。