王瓊 王凱歌 孟康康 孫聃 韓仝雨 高愛華

1) (西北大學光子學與光子技術(shù)研究所, 國家級光電技術(shù)與納米功能材料和應(yīng)用國際研究中心, 省部共建國家光電技術(shù)與功能材料重點實驗室培育基地, 陜西省光電子技術(shù)重點實驗室, 西安 710069)

2) (西北大學物理學院, 西安 710069)

1 引 言

微/納流控、微/納液滴等技術(shù)集合了物理、化學、生物、計算機及納米等前沿技術(shù), 用于生化分析與檢測[1?3]、醫(yī)療診斷[4,5]和食品安全[6]等重要領(lǐng)域, 能夠?qū)ξ⒘繕悠诽匦赃M行精準檢測分析. 將微納技術(shù)與可視化技術(shù)相結(jié)合, 在仿生環(huán)境中, 可對單個DNA 分子靈活操控、實時觀測研究其動力學特性, 不但有助于揭示生命現(xiàn)象的基本規(guī)律, 而且在分子相互作用、納米孔基因測序、藥物輸運及靶向治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[7?9].

操控單個DNA 分子, 將其有效導(dǎo)入、引導(dǎo)其穿越微納通道是實現(xiàn)DNA 生物芯片眾多功能的必備條件. 通常, 將DNA 分子順利導(dǎo)入微通道的方法有: 流體力學進樣[10](虹吸進樣法、微通道端加壓法、微通道末端抽真空法)、擴散進樣[11]、電動力進樣以及電滲驅(qū)動的流體進樣[12]等方法. 流體力學進樣法對所用設(shè)備有嚴格要求、裝置復(fù)雜、設(shè)備體積大、成本高, 同時不利于分析黏度較大的樣品; 擴散進樣法引導(dǎo)樣品進入通道內(nèi)是被動的、且難以控制; 而電動力進樣法相對容易控制,附加設(shè)備少、成本低, 在毛細管電泳分析中普遍采用.

目前, 電動力進樣法將DNA 分子導(dǎo)入微納通道仍存在尚未解決的關(guān)鍵問題. 例如, 隨著外加電場強度的改變, DNA 分子在管口附近的動力學特性、速度分布以及DNA 本身的構(gòu)象變化等不明確[13,14]; 而且, 電場力引導(dǎo)DNA 分子進入微納通道時, 不斷有新現(xiàn)象、新問題被發(fā)現(xiàn).

Wang 等[15]曾利用可視化技術(shù)研究DNA 分子在微米通道內(nèi)的電動力學特性, 發(fā)現(xiàn)DNA 分子從trans 端口進入內(nèi)徑為30 μm 通道時, 存在閾值電場強度.Yang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)DNA 分子在外電場力作用下穿越5 和10 μm 的通道時, 其運動方向會發(fā)生反轉(zhuǎn), 并且, 微米通道管徑越小, DNA 分子運動方向發(fā)生反轉(zhuǎn)時的閾值電場強度越大. 最近, Jones 等[17]發(fā)明了一種微管收縮分選DNA 分子的裝置, 采用電場力驅(qū)動DNA 分子運動, 通過改變電壓的大小與頻率調(diào)控DNA 分子在通道出口處的偏轉(zhuǎn)方向, 成功實現(xiàn)了不同大小DNA 分子的篩選; 但是, 實驗發(fā)現(xiàn)一部分分離后的DNA 分子吸附在通道的管壁上, 非常不利于芯片的持久運行.

本文利用單分子熒光成像可視化技術(shù), 實時觀察研究了l-DNA 分子在外加電場力作用下進/出微米通道端口的電動力學特性, 并基于微流體電動力學理論, 對DNA 分子在進入通道端口時的不同運動狀態(tài)的物理機制進行了初步分析.

2 實 驗

2.1 實驗裝置

實驗裝置如圖1 所示, 主要包括: 倒置熒光顯微 鏡(IX-70, 奧 林 巴 斯, 日 本); EMCCD 相 機(iXon+885, Andor, 美國); 石英玻璃圓形微米通道(邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司), 長度為5 mm,直徑為50 μm; 鉑絲電極(上海捷昱電子科技有限公司); 外接高壓電源(PS 8000 2U, EPS, 德國).實驗中, 電壓調(diào)節(jié)范圍為: 0—100 V. 圖像數(shù)據(jù)采集、分析處理均用Image 軟件(http://rsbweb.nih.gov/ij/). 整個實驗在暗室中完成, 實驗室溫度控制為25 ℃.

圖1 實驗裝置示意圖Fig. 1. Schematic diagram of experimental set-up.

圖1所示為實驗的裝置示意圖. 實驗具體步驟: 1) 導(dǎo)入緩沖液, 在cis 端口處滴入10 μl 的緩沖液, 2 s 左右緩沖液將充滿整個微米通道; 2) 導(dǎo)入DNA 分 子, 將10 μl 濃 度 為0.455 mg/L 的DNA/YOYO-1 樣品溶液滴在trans 端口, 樣品通過毛細力作用進入微通道內(nèi); 3) 待溶液處于穩(wěn)定狀態(tài), 調(diào)整電壓, 確定電場強度大小與方向.

實驗中, EMCCD 實時記錄DNA 樣品進入端口以及在微通道內(nèi)運動情況, 其曝光時間設(shè)定為100 ms, 拍攝間隔為100 ms, 每次連續(xù)拍攝持續(xù)為5 min; EMCCD一次可以連續(xù)拍 攝1000 張照片.

2.2 樣品液、微芯片的制備

實驗使用的是l-DNA 分子(富酶泰斯生物技術(shù)公司, 深圳,中國), 用染料YOYO-1 分子進行標記. 為了保證最好的熒光效率, YOYO-1 染料分子插入l-DNA 分子的配置比例為DNA 堿基對:YOYO-1 分子 = 10 : 1.

樣品溶液的制備過程如下所述: 1) 用移液槍移取100 μl 的Bis-tris (pH=8) 和1000 μl 的Tris-Hcl (pH = 8), 分別滴入標記為A 和B 的牛角管中; 2) 取0.411 μl 的DNA 原 液 和0.1 μl 的YOYO-1 原液分別加入A 和B 中, 搖勻A 和B 中的兩種溶液使其充分混合, 置于暗室孵育30 min;3) 從B 中取200 μl 的YOYO-1 稀釋液加入A 中充分混合, 在暗 室 中 孵 育30 min. 最終得到DNA/YOYO-1的混合溶液,DNA濃度為0.455 mg/L, 儲藏在暗室中備用.

微通道芯片核心部分的制備, 簡述如下: 1) 將經(jīng)過PLL(20)-g(3.6)-PEG 溶液改性后的實驗用微米通道烘干; 2) 將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)顆粒與氯仿溶液按照1∶1 進行充分混合, 制備2 個樣品池, 10 mm × 10 mm × 3 mm, 它們中間通過微米通道進行連接; 鉑絲電極正對微通道端口處;3) 將聚酰胺樹脂與環(huán)氧樹脂按1∶1 混合后均勻涂抹在樣品池的外圍, 以加固結(jié)構(gòu); 將芯片系統(tǒng)放入烤箱, 溫度60 ℃下烘烤兩小時. 實驗研究中, 為了避免DNA 分子被通道內(nèi)壁表面吸附, 采用改性液PLL(20)-PEG(2)-PEG(3.4)對微米通道內(nèi)壁進行改性處理. 本文所涉及的緩沖液pH 值都大于3,當溶液與二氧化硅通道壁面接觸時, 其表面的硅烷醇(Si—OH)基團因去質(zhì)子化而產(chǎn)生負電荷, 帶正電的PLL(多聚賴氨酸)通過靜電作用與去質(zhì)子化的硅烷醇基團相結(jié)合, 吸附在通道壁面; 不帶電的親水性聚合物PEG(乙二醇), 有效阻止生物分子非特異性吸附到管道內(nèi)壁上[18], 從而可以有效減小管壁對DNA 吸附. 實驗所用改性混合液PLL 與PEG 的質(zhì)量比 PLL∶PEG = 1∶3.6.

3 結(jié)果與分析

電場力驅(qū)動DNA 分子進入并穿越微米通道,影響DNA 分子在端口附近電動力學特性的主要因素有: 電場強度的大小、DNA 分子大小、DNA分子在微通道端口的位置、微米通道的性質(zhì)、緩沖液的性質(zhì)(濃度/PH)以及實驗溫度等條件. 本文主要研究電場強度對l-DNA 分子在50 μm通道端口處的電動力學特性的影響.

3.1 DNA 分子順利穿越微米通道的電場強度閾值

微米通道兩端施加電壓, 實驗發(fā)現(xiàn): 當電場強度E < 1.875 × 103V·m–1時, 距離trans 端口大約為100 μm 范圍內(nèi)的樣品池內(nèi)未捕捉到DNA 分子, 表明DNA 分子很難靠近trans 端口; 當電場強度E = 1.875 × 103V·m–1時, 樣品池內(nèi)的DNA分子開始緩慢靠近trans 端口, 但未進入trans 端口; 當電場強度增大到E = 2.5 × 103V·m–1時,DNA 分子開始進入trans 端口; 隨后, 逐漸增大電場強度, DNA 分子能夠進入trans 端口并順利穿越通道, 并從cis 端口順利離開; 當E > 7.5 ×103V·m–1時, 從trans 端口進入通道的DNA 分子遷移至cis 端口附近時, 部分DNA 分子發(fā)生反轉(zhuǎn)運 動, 即, DNA 分 子 的 運 動 方 向 發(fā) 生 逆 轉(zhuǎn), 由cis 端向trans 端運動, 不能夠從cis 端口穿出. 可見, DNA 分子能夠從trans 端口進入并且順利穿越微通道, 電場強度大小有合適范圍, 存在閾值:Emin= 2.5 × 103V·m–1, Emax= 7.5 × 103V·m–1.

如圖2 所示, 當電場強度E = 3.75 × 103V·m–1時, DNA 分子從trans 端口進入微米通道并在管內(nèi)的遷移.

圖2 DNA 分子從trans 端口進入微米通道并在內(nèi)部遷移(E = 3.75 × 103 V·m–1) (a) 不同時間下的CCD 照片;(b) DNA 分子位置隨時間的變化曲線Fig. 2. DNA molecules enter the microchannel from the trans port and migrate inside (E = 3.75 × 103 V·m–1): (a)CCD photographs; (b) DNA molecular position.

由圖2(a)可見, 當外加電場在閾值電場強度內(nèi), DNA 分子能夠順利進入trans 端口, 其中有2 個DNA 分子進入觀察視野范圍內(nèi), 分別用虛線橢圓和虛線菱形標識; A1~D1和A2~B2分別對應(yīng)DNA1和DNA2分子在不同時刻出現(xiàn)在微米通道內(nèi)的位置, 可以發(fā)現(xiàn): 1) DNA 分子在通道內(nèi)運動時, DNA1和DNA2分子到微米通道中心軸向的距離L1< L2, 其大小基本不變; 2) DNA1分子在trans 端口附近運動時(從A1位置到B1位置), 進入trans 端口之前是糾纏蜷縮的(A1位置), 進入通道內(nèi), 漸漸被拉伸, 長度增大, 但在微米通道內(nèi)拉伸長度變化不大; 3) 圖2(b)是DNA 分子在通道內(nèi)遷移時位置的改變, DNA1分子在0—0.5 s 內(nèi)移動距離為65.5 μm, 0.5—1.0 s 內(nèi)移動距 離為94.0 μm, 1.0—1.5 s 內(nèi)移動距離為153.0 μm, 其平均速度逐漸增大; 而DNA2分子在被捕捉時已經(jīng)進入到微通道內(nèi), 0—0.5 s 內(nèi)移動距離為70.0 μm,與DNA1分子剛進入端口時運動的距離幾乎相同.

實驗中, 還觀察到DNA 分子進入trans 端口后, 其速度會逐漸增大, 而DNA 分子穿出cis 端口時的速度逐漸減小等現(xiàn)象. 圖3 所示為DNA 分子進入trans 端口和穿出cis 端口時的速度隨時間的變化曲線.

圖3(a)為DNA 分子進入trans 端口的速度隨時間的變化. 其中DNA1, DNA2和DNA3分子分別表示距離中心軸線不等的三個DNA 分子, 距中心軸線的距離為L1< L2< L3, 速度關(guān)系為v1>v2> v3. 可見, DNA 分子從樣品池進入trans 端口之前的速度較小, 一旦進入trans 端口開始加速,進入微米通道中部后速度比較平穩(wěn); 軸線附近的DNA 分子速度大于管壁附近的DNA 分子速度.圖3(b)為DNA 分子流出cis 端口時的速度隨時間的變化特性, 實驗數(shù)據(jù)是從DNA 分子距離cis 端口大約為100 μm 的位置處開始記錄的,DNA 分子距離中心軸線的距離為L4< L5< L6 v5> v6> v7.

對比圖3(a)和圖3(b), DNA 分子進入trans端口與DNA 分子流出cis 端口的速度變化幾乎是兩個反對稱的過程. 在通道端口附近的同一橫截面處, 中心軸線附近的DNA 分子速度變化快, 而管壁附近的DNA 分子速度變化慢. DNA 分子進入trans 端口時, 速度逐漸增大, 最后保持不變; 穿出cis 端口時, 速度逐漸減小, 最終進入樣品池中的速度大小基本相同, 其主要原因是DNA 分子在樣品池中的運動主要受布朗運動的影響.

圖3(c)為DNA 分子在進入端口和離開端口處的速度隨著外加電場變化的曲線圖, 規(guī)定DNA 分子逆著電場方向的運動為正方向. 圖3(c)所示是在不同的電場強度下, 分別對通道進/出端口隨機捕捉的30—50 個DNA 分子的平均速度,DNA 分子距離中心軸線的范圍為0—14 μm. 其中, 黑色曲線為DNA 分子剛好進入端口的平均速度隨著外加電場強度的變化關(guān)系, 紅色曲線為DNA 分子剛好離開端口處的平均速度隨著外加電場強度的變化關(guān)系. 由圖3(c)可知, 當電場強度2.5 × 103V·m–1< E ≤ 7 × 103V·m–1時, DNA在入端口速度小于出端口速度; 當外加電場強為7 × 103V·m–1< E ≤ 1 × 104V·m–1時, DNA 在入端口的速度大于出端口速度.

圖3 DNA 分子進出端口的速度隨時間的變化(E = 3.75 ×104 V·m–1) (a) 進入trans 端口; (b) 穿出cis 端口; (c) 速度隨外加電場強度的變化關(guān)系Fig. 3. The velocity of DNA molecules entering and leaving the port (E = 3.75 × 103 V·m–1): (a) Entering the trans port; (b) leaving the cis port; and (c) velocity versus electric intensity.

3.2 DNA 分子的反轉(zhuǎn)運動

繼續(xù)增大電場強度, 當電場強度E > 7.5 ×103V·m–1時, 發(fā)現(xiàn)DNA 分子從trans 端口進入微米通道內(nèi), 運動至cis 端口附近時將出現(xiàn)部分DNA 分子反轉(zhuǎn)運動, 即, 運動方向發(fā)生改變, 如圖4所示.

圖4 DNA 分子在微通道內(nèi)的反轉(zhuǎn)運動 (a) E = 8.125 ×103 V·m–1; (b) E = 9.375 × 103 V·m–1; (c) 不同電場 強 度下, 在cis 端口不同區(qū)域內(nèi)的DNA 分子反轉(zhuǎn)數(shù)占總數(shù)的百分比Fig. 4. Reversed motion of DNA molecules within micro channel under different electric intensity: (a) E = 8.125 ×103 V·m–1; (b) E = 9.375 × 103 V·m–1; (c) percentage of DNA molecules with reversal motion direction in different regions of the cis port under different electric intensity.

圖4 所示為DNA 分子在不同電場力作用下穿越微米通道時, 其運動方向發(fā)生反向的情況. 如圖4(a)所示, 當外加電場強度E = 8.125 × 103V·m–1時, DNA 分子首先在通道內(nèi)沿trans→cis 方向運動(0—0.4 s 內(nèi)), 速度逐漸減小; 當DNA 分子運動至cis 端口處時, 將在徑向上遷移, 而在軸向上近似靜止(0.4—0.6 s 內(nèi)); 最后, DNA 分子運動方向發(fā)生反轉(zhuǎn), 沿cis→trans 方向運動(0.6—1.0 s內(nèi)), 速度逐漸增大. 如圖4(b)所示, 當電場強度繼續(xù)增大至E = 9.375 × 103V·m–1, DNA 分子未到達cis 端口的邊界處就開始反轉(zhuǎn), 即, 在0—0.5 s內(nèi), DNA 分子沿trans→cis 方向運動, 逆著電場方向運動; 0.5—1.2 s 內(nèi), DNA 分子沿cis→trans 方向運動, 順著電場方向運動.

為了詳細研究在不同的電場強度下DNA 分子的反轉(zhuǎn)運動沿管徑方向的變化, 對微通道進行了劃分, r 為距離中心軸線的距離, C 區(qū)域為0 ≤r1< 14 μm, S1區(qū) 域 為14 μm ≤ r3< 20 μm,S2區(qū)域為20 μm ≤ r2≤ 25 μm. 同一電場強度下, 當DNA 分子運動穩(wěn)定后統(tǒng)計10 min. 在不同外加電場強度下重復(fù)實驗, 發(fā)現(xiàn)每次實驗捕捉到的各個分區(qū)域內(nèi)DNA 分子數(shù)目占DNA 分子總數(shù)的百分比分布基本相同, 例如, 當電場強度為7.5 ×103V·m–1時, DNA 分子分布在C, S1 和S2 各區(qū)域內(nèi)的平均百分比分別約為68%, 23%和9%.圖4(c)所示是隨機的3 次實驗, 外加不同電場強度時, 發(fā)生在不同區(qū)域的反轉(zhuǎn)DNA 分子數(shù)占所捕捉的DNA 分子總數(shù)的百分比. 由圖4(c)可知, 在不同的外電場強度下, DNA 分子流出端口不同區(qū)域的反轉(zhuǎn)數(shù)占流出總數(shù)的百分比不同. 隨著電場強度的增大, DNA 分子反轉(zhuǎn)的幾率增大, 在相同的電場強度下, C 區(qū)域內(nèi)DNA 分子的反轉(zhuǎn)概率最小,其次是S1 區(qū)域, S2 區(qū)域內(nèi)DNA 分子的反轉(zhuǎn)概率最大.

隨著電場強度的繼續(xù)增大, DNA 分子運動方向發(fā)生反轉(zhuǎn)的位置距離cis 端口越來越遠, 離trans 端口越來越近; 當E = 1 × 104V·m–1時, 通道trans 端口附近的內(nèi)壁上會吸附DNA 分子; 當E > 1 × 104V·m–1時, 部分DNA 分子剛進入trans 端口內(nèi)就發(fā)生反轉(zhuǎn)運動, 返回到trans 端的樣品池中, 或者被吸附到管壁上.

DNA 分子的反轉(zhuǎn)運動方式可以分為基本的兩種類型: 1) DNA 分子首先逆著電場的方向運動至cis 端口; 然后, DNA 分子在反轉(zhuǎn)點的位置徑向遷移, 軸向上靜止; 最后, DNA 分子開始反轉(zhuǎn), 朝向trans 端口運動; 2) DNA 分子首先逆著電場的方向運動, 在未到達cis 端口時收縮成一個緊湊的小球, 似乎停止在通道中; 最后, DNA 分子直接反轉(zhuǎn)運動. 其中, 距離中心軸線較遠的DNA 分子容易發(fā)生第一種類型的反轉(zhuǎn)運動; 而中心軸線附近、或者管壁附近的DNA 分子, 或者當電場強度大于9.375 × 103V/m 時, DNA 分子容易發(fā)生第二種類型的反轉(zhuǎn)運動.

3.3 DNA 分子的往復(fù)運動以及旋轉(zhuǎn)運動

當電場強度增大至E > 9.375 × 103V·m–1時, 在trans 端口附近, 發(fā)現(xiàn)DNA 分子具有周期性往復(fù)運動的現(xiàn)象.

如圖5(a)所示, 當電場強度E > 9.375 ×103V·m–1時, 在trans 端口附近, 單個DNA 分子在一個周期內(nèi)的往復(fù)運動, 周期約為3.0 s, 其中,紅色箭頭表示DNA 分子的運動方向.

圖5 DNA 分子在trans 端口附近沿軸向的運動 (a) 往復(fù)運動; (b) 旋轉(zhuǎn)運動Fig. 5. The motion of DNA molecules near the trans port:(a) Reciprocating along the axis; (b) rotating.

如圖5(b)所示, 當電場強度E = 1×104V/m時, 捕捉到多個DNA 分子的往復(fù)運動, 分別用圓形虛線、菱形虛線標記. 其中, 黃色箭頭表示單個DNA 分子(圓形虛線標記)在軸向上往復(fù)運動的方向, A1—A5表示DNA 分子在不同時刻的位置,它在軸向上的運動距離較大, 自身無旋轉(zhuǎn); 紅色箭頭表示團聚在一起的多個DNA 分子(菱形虛線標記)繞著自身旋轉(zhuǎn)的方向, 其方向指向管壁(順時針旋轉(zhuǎn)), B1—B5表示DNA 分子在不同時刻的位置, 團聚的DNA 分子在軸向上往復(fù)運動的距離較小, 藍色虛線表示DNA 做往復(fù)運動時的平衡位置.

圖6 是圖5(b)中團聚的DNA 分子在10 s 內(nèi)往復(fù)運動的軌跡. 其中, 藍色曲線為DNA 分子運動的軌跡, 紅色虛線為DNA 分子在運動過程中平衡位置的擬合曲線, 圖中兩點之間的時間間隔為0.1 s.

圖7 所示為通道trans 端口附近的內(nèi)壁上吸附DNA 分子的情形, 圖7(a)和圖7(b)的電場強度分別為7.5 × 103和1 × 104V·m–1, 由圖7 可知, 隨著電場強度的增大, 吸附在內(nèi)管壁的DNA 分子數(shù)量增多.

圖6 DNA 分子在trans 端口附近的往復(fù)運動(E = 9.375 ×103 V·m–1)Fig. 6. The track of DNA molecules reciprocating near the trans port (E = 9.375 × 103 V·m–1).

圖7 不同電場強度下的trans 端口附近通道內(nèi)壁團聚有DNA 分子 (a) E = 7.5 × 103 V·m–1; (b) E = 1 × 104 V·m–1Fig. 7. Aggregates of DNA molecules on the wall of microchannel near the trans port; (a) E = 7.5 × 103 V·m–1;(b) E = 1 × 104 V·m–1.

3.4 DNA 分子進/出微通道端口機制

圖8 所示是流體在通道內(nèi)的速度分布以及DNA分子的受力和運動示意圖. 由于微米通道端口處存在反壓差, 通道內(nèi)流體速度是電滲流和反壓差流的疊加, 流體的流速不再是理想的塞狀分布[19].

圖8 中, 灰色帶箭頭的線段表示流體的速度分布, 流體在通道trans/cis 端口的速度是順著電場方向的電滲流流速與逆著電場方向的泊肅葉(Poiseuille)拋物線流速的疊加. 流體在徑向上存在速度梯度; 另外, 由于端口處存在明顯的反壓差作用以及可能存在的污染、管口不平整等因素, 緩沖液沿軸向也存在速度梯度.

圖8 緩沖液在微米通道內(nèi)的流速分布以及DNA 受力和速度示意圖 (a)受力; (b)速度Fig. 8. Schematic diagram of buffer velocity distribution in microfluidic channel and the infromation of DNA: (a) Force;(b) velocity.

如圖8(a)所示, DNA 分子在trans/cis端口處沿軸向的受力為

沿徑向的受力為

DNA 分子在微通道內(nèi)部只受到沿軸向的作用力, 其大小為

圖8 中,f1=f電泳力=qE;f2,f3分 別 為 軸向流體阻力和徑向流體阻力, 其大小為f流體阻力=6πaμ(vf?vp) , 其方向與速度矢量差的方向相同;, 反壓差力也是由壓強梯度引起的; 薩夫曼力的大小為fs=Kμ(vf?vp)a2|G/υ|1/2. 式中,q為DNA 分子的帶電量,E為電場強度,a為DNA 分子的半徑,vf,vp分別為流體的速度和DNA 分子的速度,μ表示流體黏度,u為流體運動黏度,G為局部流體速度梯度,?p/?x為軸向的壓強梯度.

當DNA 分子與壁面之間的距離很近時存在靜電作用, 其大小為[20]

其 中k?1為德拜長度;kB玻爾茲曼常量;y1為DNA 分子到管壁的距離;zwall和zDNA分別為壁面Zate 電勢和DNA 的表面電勢, 與DNA 的帶電量和緩沖液的PH 有關(guān).

由(1)式和(2)式可知, DNA 分子所受合力的大小與外加電場強度、緩沖液速度、DNA 分子大小、DNA 電泳速度、管徑大小等因素有關(guān).

圖8(b)是流體和DNA 分子在通道中的運動示意圖. 實驗中使用的緩沖液pH > 3, 與管壁接觸時管壁帶負電; 當微米通道兩端施加電場時, 微通道內(nèi)的緩沖液將形成電滲流, 其移動方向為cis→trans; 由于DNA 分子顯負電性, DNA 分子電泳的方向與電滲流方向相反, 為trans→cis. 理想狀態(tài)下, DNA 分子等帶電粒子在微米通道中運動的速度是電泳[21,22]和電滲流[23,24]的疊加. 規(guī)定DNA 分子電泳速度方向為正, 則DNA 分子在微通道中運動的有效速度veff為

當微米通道長度為無限長的理想情況時, 流體在微通道中的速度可以用電滲流速度來表示, 即,vf=εζwallE/4πμ. 然而, 實際的微米通道為有限長,通道端口流體的速度是電滲流和反壓差流動速度的疊加, 即[20,25]:

其中e是溶液的介電常數(shù);ψ(y2) 為距離中心線為y2處的電勢;h為通道的半徑.

實驗中, 樣品池的邊長(L= 10000 μm)相對于微通道的內(nèi)徑(D= 50 μm)以及DNA 分子的回轉(zhuǎn)半徑(Rg= 0.7 μm), 幾乎是一個三維無限大的儲液池. DNA 分子在樣品池內(nèi)將處于糾纏狀態(tài),當其從trans端口進入通道, 是逆著流體流動的方向遷移, DNA 分子進入以及穿越微米通道的過程中始終受到一個逆向流體的作用力[26].

研究發(fā)現(xiàn)[15], 電場力驅(qū)動DNA 分子從trans端進入并順利穿越內(nèi)徑為30 μm 的通道時, 最小閾值電場強度為Emin= 7 × 103V·m–1. 本研究發(fā)現(xiàn), DNA 分子從trans端口進入并順利穿越內(nèi)徑為50 μm 通道時的最小閾值電場強度Emin= 2.5 ×103V·m–1. 即, 通道內(nèi)徑越小, 電場強度閾值越大.這種現(xiàn)象符合電滲流壓力同濕周長度C與通道截面積A的比值成正比的規(guī)律[27].

由(6)式與(7)式可得, DNA 分子在微米通道內(nèi)同一橫截面上的有效速度:

(8)式等號左側(cè)的第二項為定值, 因此,DNA 分子的有效速度與徑向距離y2的關(guān)系是開口向下的拋物線, DNA 分子沿軸向的有效速度在中心軸線處將最大.

圖9 所示是DNA 分子在流出端口同一截面不同位置處沿軸向速度的實測數(shù)值與理論計算值.其中, 橫坐標為DNA 分子距離中心軸線的距離,dp/dx= 0.04 Pa/m,μ= 1.011 × 10–3Pa·s,y2=4.5, 13.5, 22.5 μm,藍色曲線為理論DNA 分子速度, 紅色曲線為實測速度. 從圖9 可以明顯看出, 隨著DNA 分子距離中心軸線越遠, 其軸向有效速度越小; 理論與實驗相吻合.

圖9 DNA 分子在端口同一截面不同位置的實測速度與理論速度Fig. 9. Measured and theoretical velocities of DNA molecules at different positions on the same cross section of near the microchannel port.

外加電場不同, DNA 分子在通道內(nèi)出現(xiàn)不同的運動狀態(tài), DNA 的反轉(zhuǎn)運動主要出現(xiàn)在cis端口, 往復(fù)運動和旋轉(zhuǎn)運動出現(xiàn)在trans端口.

圖10 所示為DNA 分子從trans端口進入微米通道, 并隨著電場強度的改變, 在端口附近其反轉(zhuǎn)運動發(fā)生位置點變化示意圖. 圖10(a)和圖10(b)為DNA 分子在不同電場強度下的反轉(zhuǎn)運動過程.其中, 圖10(a)的電場強度范圍為7.5 × 103V·m–1≤E≤ 1 × 104V·m–1, 圖10(b)的電場強度范圍為E> 1 × 104V·m–1.

圖10 DNA 分子在微米通道內(nèi)端口附近處的反轉(zhuǎn)運動示意圖 (a) DNA 分子在cis 端口處反轉(zhuǎn), 反 轉(zhuǎn)后的DNA 分子容易吸附在微米通道內(nèi)管壁上, 7.5 × 103 V·m–1 ≤ E ≤1 × 104 V·m–1; (b) DNA 分子在trans 端口附近的反轉(zhuǎn)運動, E > 1 × 104 V·m–1Fig. 10. Schematic diagram of DNA molecules moving near the port of microchannel: (a) reversing near the cis port,and the reversed DNA molecule is easy to be adsorbed onto the inner wall, 7.5 × 103 V·m–1 ≤ E ≤ 1 × 104 V·m–1; (b)reversing near the trans port, E > 1 × 104 V·m–1.

由圖10(a)可知, DNA 分子是逆著流速靠近cis端口. DNA 靠近cis端口, 其電泳力和電滲流阻力幾乎不變, 流體的阻力雖然逐漸減小, 但壓強梯度力卻逐漸增大, 導(dǎo)致DNA 分子的運動速度逐漸減小. 圖10(a)中用虛線圓標記了一個在cis端口將要反轉(zhuǎn)的DNA 分子所處的位置, 此時, 壓強梯度力與DNA 分子表面的電滲流阻力之和大于DNA 分子所受電泳力, 使得DNA 開始反轉(zhuǎn)運動.

電場強度的大小能夠影響DNA 分子反轉(zhuǎn)點的位置. 當外電場達到反轉(zhuǎn)電場強度時, 電場強度越大, DNA 分子速度減小越快, 反轉(zhuǎn)運動之前沿trans→cis方向運動的距離越小, 距離cis端口處越遠. 如圖10(b)所示, 外加電場強度E> 1 ×104V·m–1,菱 形 標 記 的 一 個DNA 分 子 靠 近trans端口, 此時, DNA 分子受力滿足條件:f電泳力+f壓強梯度力+f反壓差力>f軸向流體阻力+f電滲流阻力, 因此它能夠進入trans端口. 當DNA 分子進入通道內(nèi)部, 運動到圓虛線標記的位置時, 反壓差力和壓強梯度力很小, 甚至消失, 電泳力不足以主導(dǎo)DNA 分子繼續(xù)遷移, 此時DNA 分子在電滲流阻力的主導(dǎo)下反轉(zhuǎn)運動, 沿cis→trans的方向運動.需要說明的一點是, 外加電場的增大會產(chǎn)生焦耳熱, 進而引起緩沖液的黏度減小; 而且, 在散熱的過程中, 微米通道沿徑向有溫度梯度, 將影響微通道內(nèi)部流體的速度分布, 對DNA 分子的運動也會產(chǎn)生影響.

另外, 電場強度越大對DNA 分子構(gòu)象的影響較明顯, 使其表面電荷分布發(fā)生改變. 如圖5(a)所示, DNA 分子在構(gòu)象上高度壓縮, 其表面電荷密度將發(fā)生改變; 圖5(b)所示, 電場強度超過1 ×104V/m, DNA 分子收縮成一個相當緊湊的小球,導(dǎo)致DNA 分子表面電荷密度分布發(fā)生改變, 各向同性增強[28], 表面電勢(zDNA)發(fā)生變化將導(dǎo)致DNA 分子電泳力發(fā)生改變[29]. 圖5(a)中, DNA 分子逆著流體的方向進入通道, 在1.0 s 時刻, DNA分子未到達cis端口, 但是其有效速度已減小為零.由于在該電場強度下, DNA 分子的電滲流淌度大于電泳淌度, 使得DNA 分子不能保持靜止狀態(tài),因此下一刻DNA 分子的運動方向開始反轉(zhuǎn), 轉(zhuǎn)向cis→trans運動. 當?shù)竭_trans端口附近時, 有效速度再次減小為零(2.0 s 時刻), 此時DNA 分子的受力 為f電泳力+f壓強梯度力+f反壓差力>f電滲流阻力, 導(dǎo)致DNA 分子不能流出trans端口, 在此位置再一次進行反轉(zhuǎn), 轉(zhuǎn)向trans→cis運動, 形成一次往復(fù)運動.

電場強度繼續(xù)增大, 并不能促使DNA 分子在電泳的主導(dǎo)下向著cis端管口遷移, 反而加快DNA 分子往復(fù)運動的頻率. DNA 分子在往復(fù)運動的過程中, 偏向管壁運動時速度減小. 由圖6 可以看出, DNA 分子在往復(fù)運動的過程中逐漸地靠近管壁, 同時DNA 分子往復(fù)運動的軸向距離逐漸減小. 當電場強度E> 7.5 × 103V·m–1時, DNA 分子明顯偏向管壁運動, 主要原因是在trans端口附近, 反壓差的作用使得DNA 分子周圍的流體存在速度梯度, 受到薩夫曼力的作用[30], 方向指向管壁.關(guān)于DNA 分子的旋轉(zhuǎn)運動, 則主要是由于DNA 分子周圍的緩沖液在徑向和軸向上都存在速度梯度. 當團聚的DNA 分子質(zhì)量較大時, 就有可能出現(xiàn)徑向位置變化較小的旋轉(zhuǎn)運動. 如圖5(b)所示, 中心軸線右側(cè)團聚的DNA 分子周圍的流體存在速度梯度, 距離中心軸線越近流體速度越小,此時DNA 分子向著管壁處旋轉(zhuǎn); 當DNA 分子的旋轉(zhuǎn)角速度矢量與運動的速度矢量不重合時, 在與旋轉(zhuǎn)角速度矢量和平動速度矢量組成的平面相垂直的方向上將產(chǎn)生一個徑向力, 即, 馬格努斯力[31].薩夫曼力和馬格努斯力之間存在互動性; DNA 分子將在以上多種力的共同作用下做復(fù)雜的旋轉(zhuǎn)運動.

4 結(jié) 論

本論文利用單分子熒光顯微成像方法比較系統(tǒng)地研究了l-DNA 分子在外電場力作用下進入、穿越內(nèi)徑為50 μm 的圓形通道的電動力學特性.研究結(jié)果表明: DNA 分子能夠進入微米通道trans端口并順利穿越微通道存在最小閾值電場強度Emin= 2.5 × 103V·m–1和最大閾值電場強度Emax= 7.5 × 103V·m–1. 只有當外電場強度滿足2.5 × 103V·m–1≤E≤ 7.5 × 103V·m–1時, 才能夠引導(dǎo)DNA 分子從trans端口進入通道, 并順利從cis端口穿越. 當外電場小于Emin時, DNA 分子只能靠近trans端口, 但不能通過trans端口進入通道; 外加電場強度7.5 × 103V·m–1 1× 104V·m–1時, DNA 分子在樣品池內(nèi)很難靠近trans端口. 在外電場力作用下, DNA 分子從容積較大的樣品池內(nèi)進入微米通道, 在通道內(nèi)沿軸向主要受電泳力、壓強梯度力、反壓差力、流體阻力以及電滲流阻力等的作用; 電場強度的改變, 將引起緩沖液的流速以及DNA 分子受力情況的改變, 進一步影響其動力學特性. 本研究結(jié)果對研制基于微納通道系統(tǒng)的DNA 分子傳感器和芯片實驗室等具有一定的指導(dǎo)意義.