俎峰 李霞 何曉瑩 趙凱琴 陳葦 束正齊 董云松

摘要：通過(guò)油菜（Brassica napus）雜交種深孔板內(nèi)發(fā)芽，簡(jiǎn)化堿裂解法提取DNA步驟，配合高通量研磨器Fast&Fluid Management SK300樣品混勻儀的使用，提供了一整套快速高通量低成本獲取油菜雜交種子葉DNA樣品的集約化方案。該方法可以實(shí)現(xiàn)10 h完成萬(wàn)份DNA樣品的提取，極大提高了DNA獲取效率，有利于利用分子標(biāo)記對(duì)雜交油菜種子進(jìn)行純度鑒定。

關(guān)鍵詞：油菜（Brassica napus）;雜交種;DNA提取;分子標(biāo)記;純度鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（ 2020）12-0179-03

D01：10.1408 8/j .cnki.issn043 9- 8114.2020.12.040

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

油菜（Brassica napus）是典型的異花授粉作物，雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)。目前在中國(guó)大部分油菜種植區(qū)所種植的油菜品種為雜交種。油菜雜交品種在出售前需要進(jìn)行嚴(yán)格的純度鑒定。傳統(tǒng)的雜交油菜純度鑒定多采用異地田間種植[1]和蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)[2]。田間種植鑒定所需周期長(zhǎng)，成本高，且對(duì)鑒定人員的經(jīng)驗(yàn)依賴(lài)度較高，鑒定結(jié)果不穩(wěn)定，較難適應(yīng)當(dāng)年供種的生產(chǎn)需要[3]。蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)多以同工酶和貯藏蛋白電泳條帶為依據(jù)，這類(lèi)標(biāo)記多態(tài)性相對(duì)較低，且受到電泳技術(shù)影響，在雜交種純度檢測(cè)應(yīng)用方面受到限制[4]。分子標(biāo)記具有遺傳信息豐富，檢測(cè)不受季節(jié)、環(huán)境影響的優(yōu)點(diǎn)，是目前最實(shí)用的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)[5]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記檢測(cè)手段越來(lái)越多地被應(yīng)用到油菜雜交種純度鑒定中[6-7]。為此眾多研究者針對(duì)DNA提取的方法、步驟及樣品如何研磨進(jìn)行了簡(jiǎn)化與優(yōu)化研究[8-11]。但是，這些研究在實(shí)際應(yīng)用于分子標(biāo)記檢測(cè)油菜雜交種純度時(shí)缺乏系統(tǒng)性與整體性，DNA提取效率與通量還有待提升。

本研究在前人工作基礎(chǔ)上，系統(tǒng)整合深孔板內(nèi)發(fā)芽技術(shù)與簡(jiǎn)化堿裂解法提取DNA技術(shù)，并配合高通量研磨器Fast&Fluid Management樣品混勻儀的使用，以期提供一整套快速高通量低成本獲取油菜雜交種子葉DNA樣品的集約化方案。

1 材料與方法

1.1 材料

油菜種子為云南省強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合云油雜15號(hào)及其雙親材料IIXS08IA與10016C，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所油菜中心提供。

所用試劑為0.2%的瓊脂糖凝膠、0.2 mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的Tris-HCI溶液。

儀器設(shè)備有0.4 cm瓷珠、Eppendorf連續(xù)分裝器、Fast&Fluid Management SK300樣品混勻儀、Ep-pendorf AC 22331 Hamburg（型號(hào)0034546）高速平板離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 雜交種播種與發(fā)芽配制0.2%的瓊脂糖凝膠冷卻至室溫。先利用連續(xù)分裝器在96孔深孔板中每孔（規(guī)格2mL）加入0.20 mL 0.2%的凝膠，再每孔播人1粒油菜種子，保鮮膜密封深孔板，光照培養(yǎng)箱/室發(fā)芽3-7 d，每天光照16 h，黑暗8h。

1.2.2 DNA提取待子粒發(fā)芽，子葉展開(kāi)（60°～180°），深孔板每孔內(nèi)加入瓷珠1顆，再利用連續(xù)分裝器加入0.25 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液。之后將深孔板置于95℃水浴鍋內(nèi)水浴3 min，取出后加蓋乳膠封口膜，置于Fast&Fluid Management SK300樣品混勻儀中進(jìn)行樣品研磨，時(shí)間設(shè)定為2 min。取出研磨好的深孔板，打開(kāi)封口膜，利用連續(xù)分裝器每孔加入0.75 mL 0.1 mol/L的Tris-HCI溶液。最后將深孔板（每次4板）精確稱(chēng)重后對(duì)稱(chēng)置于高速平板離心機(jī)，4 000 r/min離心2-5 min，輕輕取出。離心好的深孔板其上清液可直接用于后期PCR擴(kuò)增，吸取上清液即為樣品DNA，-20℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)與垂直板電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增體系：50 ng DNA，lxPCR緩沖液，2.0 mmol/L MgCl：，0.2 mmol/L dNTPs，0.5 UTaq酶，正向及反向SSR引物各12.5 ng，反應(yīng)總體積為10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，60℃（-0.5℃/循環(huán)）退火30 s，72℃延伸45 s，9個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物于6%變性PACE凝膠上電泳th分離，采用0.5xTBE，80V電壓。電泳完成后，銀染法顯帶，用數(shù)碼相機(jī)拍照保存圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交種深孔板中發(fā)芽

播種后2d，油菜種子在深孔板中發(fā)芽，3-7 d子葉展開(kāi)60°-180°（圖1]，即可用于DNA提取。在此期間，0.2 mL 0.2%的黏稠態(tài)瓊脂糖凝膠可保護(hù)種子不沉人深孔板底部，為種子發(fā)芽提供足夠的水分及為幼芽提供根部附著與支撐，同時(shí)深孔板孔內(nèi)也有足夠的空間供種子發(fā)芽，子葉伸展。保鮮膜密封深孔板可保護(hù)其中的水分不被蒸發(fā)，期間不再需要人為補(bǔ)充水分，降低管理與用工成本。

2.2 10 h完成萬(wàn)份DNA提取

Fast&Fluid Management SK300樣品混勻儀一次可放人4塊96孔深孔板，2 min完成研磨，th即可研磨上萬(wàn)份樣品，極大地提高了樣品研磨的通量。研磨過(guò)后95℃水浴鍋水浴3 min，依據(jù)水浴鍋的大小，105塊深孔板（10 080份樣品）可在1-2 h完成。Eppendorf AG 22331 Hamburg高速平板離心機(jī)每次可離心4塊深孔板，離心2-5 min。按離心5 min計(jì)算，105塊深孔板約3h即可完成。由此可見(jiàn)此種方法固定的操作時(shí)間短于6h，配合使用連續(xù)分裝器添加相應(yīng)試劑，10 h可以完成萬(wàn)份DNA提取。

2.3 雜交種DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

利用提取的DNA作為模板，PCR擴(kuò)增后，電泳結(jié)果顯示該方法提取的DNA可擴(kuò)增出清晰的條帶，96個(gè)樣品中共計(jì)有7個(gè)父本純合基因型單株（圖2），由此計(jì)算出本試驗(yàn)使用的云油雜15號(hào)雜交種樣品純度為92.7%。

3 討論

分子標(biāo)記檢測(cè)雜交種純度需要確定單顆種子的基因型，而油菜種子較小，尚無(wú)法實(shí)現(xiàn)低成本高通量獲取油菜單粒干種子DNA。因此單顆種子DNA的提取一般都包含以下2個(gè)步驟：第一步，種子發(fā)芽，獲取單粒種子子葉或葉片樣本;第二步，子葉或葉片DNA提取。雖然目前提取DNA的方法已經(jīng)被研究者多方優(yōu)化與簡(jiǎn)化[8，9]，但多局限于某一個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)的改良，如樣品研磨[8]或方法改良[9]，均未能有效地整合上述DNA提取的兩個(gè)步驟，無(wú)法避免人工單個(gè)子葉/植株取樣分裝進(jìn)離心管這一費(fèi)工費(fèi)力費(fèi)時(shí)的環(huán)節(jié)，亦無(wú)法實(shí)現(xiàn)種子發(fā)芽與DNA提取過(guò)程的無(wú)縫對(duì)接。本研究利用深孔板種子發(fā)芽后直接放人Fast&Fluid Management SK300樣品混勻儀，減少發(fā)芽后再取樣的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了發(fā)芽與DNA提取的無(wú)縫對(duì)接，縮減工序提高效率。同時(shí)本研究進(jìn)一步簡(jiǎn)化了現(xiàn)有的堿裂解法提取DNA步驟，再配合Fast&Fluid Management SK300樣品混勻儀的使用，有效地整合了DNA提取的兩個(gè)步驟，提出了一整套集約化方案，實(shí)現(xiàn)10 h完成萬(wàn)份DNA樣品的提取，極大提高了DNA獲取效率，節(jié)約了人力和物力，能夠顯著降低分子標(biāo)記檢測(cè)雜交種純度的成本與時(shí)間。

由于使用的是堿法提取DNA，DNA有效保存時(shí)間較短。在高通量獲取到雜交種DNA后，需要及時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，高效快速配制上萬(wàn)份DNA材料的PCR反應(yīng)體系是個(gè)不小的挑戰(zhàn)。為此本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)明了用于PCR反應(yīng)體系批量配制的簡(jiǎn)易高通量移液器[12]。使用該移液器，可一次性完成整板（96孔）PCR反應(yīng)體系DNA模板的添加，并免去了傳統(tǒng)的移液器吸頭的使用[12]。因此，本DNA提取方法配合用于PCR反應(yīng)體系批量配制的簡(jiǎn)易高通量移液器的使用能極大提高分子標(biāo)記檢測(cè)油菜雜交種純度的效率，縮減成本。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱國(guó)富，夏英萍.雜交油菜種子異地純度鑒定技術(shù)探討[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，10（2）：32.

[2]王同華，曲亮，謝運(yùn)河，等，醇溶蛋白電泳與田間種植鑒定油菜雜交種純度的相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（16）：17-18.

[3]農(nóng)業(yè)部全國(guó)農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心.農(nóng)作物種子檢驗(yàn)員考核學(xué)習(xí)讀本[M].北京：中國(guó)T商}H版社，2006.259-273.

[4]王中仁.植物等位酶分析[M].北京：科學(xué)H{版社，1996.69-73.

[5]郝曉華，郝曉玲.分子標(biāo)記在作物育種中應(yīng)用價(jià)值研究[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2015（8）：17-19.

[6]盧虹，徐愛(ài)遐.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在甘藍(lán)型油菜雜交種陜油16純度鑒定中的應(yīng)用[J].種子，2016，35（6）：123-126.

[7]薛艷，李英，張星，等鑒定甘藍(lán)型油菜雜交種種子純度的SSR分子標(biāo)記引物篩選[J]種子，2017，36（6）：125-127.

[8]高飛，張?zhí)铮斡裼?，?油菜品種DNA提取方法優(yōu)化[J].種子，2010，29（1）：27-30.

[9]張寧潔，熊光明，朱文秀，等.甘藍(lán)型油菜高質(zhì)量DNA提取方法研究[J].農(nóng)家之友（理論版），2010（9）：106-107.

[10]李佳，沈斌章，韓繼祥，等一種有效提取油菜葉片總DNA的方法[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，13（5）：521-523.

[11]嚴(yán)明理，劉忠松，官春云，等用于PCR分析的芥菜型油菜總DNA的快速提取[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（16）：172-173.

[12]俎峰，李霞，何曉瑩，等用于PCR反應(yīng)體系批量配制的簡(jiǎn)易高通量移液器[P].中國(guó)專(zhuān)利：CN207287473 U.2017-07-11.

基金項(xiàng)目：國(guó)家白然科學(xué)基金項(xiàng)目（31760394）;云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)（2017FC001-070）;農(nóng)業(yè)部云貴高原馬鈴薯與油菜科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站

作者簡(jiǎn)介：俎峰（1984-），男，河南許昌人，副研究員，碩士，主要從事分子標(biāo)記輔助油菜育種研究，（電話(huà)）15398406665（電子信箱）zufeng1984@163.com;通信作者，陳葦（1967-），女，云南昆明人，研究員，碩士，主要從事油菜種質(zhì)創(chuàng)新與育種應(yīng)用研究。