張浩科，高 靜，宮海燕

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆塔城市人民醫(yī)院藥劑科，新疆 塔城 834700)

新疆芍藥(PaeoniasinjiangensisK.Y.Pan)為毛茛科芍藥屬多年生草本植物的干燥紡錘狀塊根[1]，味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散淤止痛的功效[2]，主治月經(jīng)不調(diào)等，是婦科疾病的常用藥物。新疆芍藥主產(chǎn)于新疆阿勒泰地區(qū)山坡及披針葉林下或林間灌叢，維吾爾藥名為“克孜力出胡魯克”，與赤芍同科同屬，藥材名亦稱作赤芍，分布較廣，是許多中藥成方制劑的重要組成藥味[3]。新疆芍藥的主要化學(xué)成分為芍藥苷[4]、白芍苷、芍藥新苷等，但其總多酚成分鮮有報(bào)道。新疆芍藥在新疆大量種植與收購(gòu)，其所含的總多酚成分是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚類化合物，具有抗氧化、抗衰老[5-8]、抑菌[9]、降脂[10-11]等作用及較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，可作為新的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基的產(chǎn)品，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，尤其是在癌癥、心血管疾病的治療方面具有較大的潛力。

變異鏈球菌(Streptococcusmutans)是齲齒公認(rèn)的主要致齲菌，齲齒發(fā)病率高，分布廣，是口腔主要的常見(jiàn)病，也是人類最普遍的疾病之一，世界衛(wèi)生組織已將其與腫瘤和心血管疾病并列為人類三大重點(diǎn)防治疾病。

新疆芍藥在中醫(yī)臨床治療中有著廣闊的應(yīng)用前景，隨著研究的深入，新疆芍藥在醫(yī)學(xué)、食品等行業(yè)具有越來(lái)越重要的作用。新疆芍藥研究目前主要集中于對(duì)芍藥苷等化學(xué)成分的檢測(cè)，前期研究[12]發(fā)現(xiàn)，新疆芍藥總多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白色念珠菌均具有一定的體外抑菌活性，但關(guān)于新疆芍藥總多酚的含量檢測(cè)及其對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌活性尚未見(jiàn)報(bào)道。

作者在此對(duì)新疆芍藥的顯微特征進(jìn)行鑒定，建立新疆芍藥總多酚的含量測(cè)定方法，評(píng)價(jià)新疆芍藥總多酚對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌活性，為有效開(kāi)發(fā)利用新疆芍藥資源、初步篩選安全有效的防齲藥物和研究新疆芍藥總多酚的抑菌作用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

新疆芍藥(PaeoniasinjiangensisK.Y.Pan)，采自新疆阿勒泰地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院主任藥師李永和鑒定，存于新疆醫(yī)科大學(xué)中藥民族藥標(biāo)本館(標(biāo)本號(hào)2010-356)。

沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)110831-200302)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；福林試劑，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；碳酸鈉，分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

顯微鏡，Carl Zeiss MicroImaging GmbH；數(shù)碼顯微攝像儀(Motic Image Advanced 3.2,Motican 2306)；AL-204型電子天平(0.1 mg)，梅特勒-托利多儀器有限公司；SK3300LH型超聲波發(fā)生器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；GBC DBUV-Cintra 40型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；TDL-40B型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

變異鏈球菌(Streptococcusmutans)由美國(guó)典型物種保藏中心提供。

腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基，美國(guó)BD公司；瓊脂(MH)培養(yǎng)基，英國(guó)Oxoid公司。

1.3 新疆芍藥的顯微鑒定

參照文獻(xiàn)[12]配制水合氯醛和稀甘油：稱取水合氯醛50 g，加入蒸餾水15 mL、甘油10 mL，混勻溶解，即得水合氯醛；取甘油33 mL，加蒸餾水稀釋至100 mL，加液化苯酚1滴，即得稀甘油。

用解剖針挑取新疆芍藥粉末適量，置于載玻片中央；滴加水合氯醛1～3滴，用解剖針攪拌均勻，置于酒精燈上加熱攪拌至凝固；冷卻后，滴加稀甘油1～2滴，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸取邊緣多余液體及粉末，置于顯微鏡下觀察。

1.4 新疆芍藥總多酚的提取

將新疆芍藥粉碎，過(guò)60目篩；稱取10.0 g置于錐形瓶中，加入100 mL 80%乙醇，浸泡1 h；超聲(45 ℃，80 Hz)提取45 min，離心，過(guò)濾，即得新疆芍藥總多酚提取液。

1.5 新疆芍藥總多酚含量的測(cè)定

1.5.1 沒(méi)食子酸對(duì)照儲(chǔ)備液的制備

精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解，定容至刻度，即得0.1 mg·mL-1沒(méi)食子酸對(duì)照儲(chǔ)備液。

1.5.2 樣品溶液的制備

取60 mL新疆芍藥總多酚提取液，加入80%乙醇定容至100 mL，即得樣品溶液。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取沒(méi)食子酸對(duì)照儲(chǔ)備液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中；各加6 mL蒸餾水、0.5 mL福林試劑，充分搖勻；1 min后加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容；于75 ℃水浴反應(yīng)10 min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定760 nm處吸光度。以沒(méi)食子酸濃度(c，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程。

1.5.4 樣品測(cè)定

精確量取100 μL樣品溶液，加入6 mL蒸餾水、0.5 mL福林試劑、1.5 mL 20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL，75 ℃水浴10 min，冷卻后測(cè)定760 nm處吸光度，平行測(cè)定3次，依據(jù)線性回歸方程計(jì)算新疆芍藥總多酚含量。

1.6 新疆芍藥總多酚對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌活性評(píng)價(jià)

藥液的制備：將新疆芍藥總多酚提取液經(jīng)冷凍干燥后，得干燥粉末，用無(wú)菌生理鹽水溶解，并過(guò)0.22 μm濾膜，稀釋成5個(gè)不同的濃度：144.48 mg·mL-1、72.24 mg·mL-1、36.12 mg·mL-1、18.06 mg·mL-1、9.03 mg·mL-1。

菌液的制備：將保藏的變異鏈球菌菌種從-80 ℃冰箱中取出，復(fù)蘇傳代，孵育18～24 h；取單個(gè)菌落接種于BHI培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18～24 h；用無(wú)菌生理鹽水將菌液調(diào)至1×105CFU·mL-1。

按菌液與藥液體積比1∶10，將菌液分別加到不同濃度的總多酚溶液中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18～24 h，應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算平均菌落數(shù)，分析新疆芍藥總多酚對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌活性。以氨芐西林溶液作為對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 新疆芍藥的顯微特征

利用顯微成像技術(shù)和顯微鑒定法，對(duì)新疆芍藥粉末進(jìn)行顯微鑒定。從粉末制片中可觀察到纖維、非腺毛、螺紋導(dǎo)管、氣孔、柵欄細(xì)胞，如圖1所示。

圖1 新疆芍藥粉末的顯微鑒定

2.2 新疆芍藥總多酚的含量

以沒(méi)食子酸濃度(c，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合，得線性回歸方程y=137.25x+0.09221(R2=0.999)，線性范圍為0.001～0.005 mg·mL-1，即沒(méi)食子酸濃度在0.001～0.005 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

取新疆芍藥總多酚提取液按1.5.2制備樣品溶液，測(cè)定760 nm處吸光度，依據(jù)線性回歸方程計(jì)算新疆芍藥總多酚含量為(9.58±1.03)mg·g-1。

2.3 方法學(xué)考察

(1)穩(wěn)定性：取樣品溶液，分別于0 min、10 min、20 min、40 min、80 min、160 min按1.5.4方法測(cè)定總多酚含量。計(jì)算RSD為0.96%(n=6)，表明樣品在160 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(2)精密度：取樣品溶液按1.5.4方法測(cè)定總多酚含量，重復(fù)測(cè)定5次。計(jì)算RSD為0.23%(n=5)，表明該方法精密度良好。

(3)重復(fù)性：取樣品溶液5份，按1.5.4方法測(cè)定總多酚含量。計(jì)算RSD為1.1%(n=5)，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

(4)加標(biāo)回收率：精密稱取6份已知含量的新疆芍藥粉末5.0 g，分別精密加入沒(méi)食子酸200 mg，置于250 mL具塞錐形瓶中，按1.5.4方法測(cè)定總多酚含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，加標(biāo)回收率為96.83%～103.07%，平均值為99.84%，RSD為2.27%，表明該方法準(zhǔn)確性較好。

2.4 新疆芍藥總多酚對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌活性

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新疆芍藥總多酚對(duì)變異鏈球菌具有一定的體外抑菌活性，最低抑菌濃度(MIC)為72.24 mg·mL-1，在配制的濃度范圍(144.48 mg·mL-1、72.24 mg·mL-1、36.12 mg·mL-1、18.06 mg·mL-1、9.03 mg·mL-1)內(nèi)未檢測(cè)出新疆芍藥總多酚對(duì)變異鏈球菌的最低殺菌濃度(MBC)。對(duì)照組氨芐西林對(duì)變異鏈球菌的MIC為60 μg·mL-1、MBC為120 μg·mL-1。

3 結(jié)論

對(duì)新疆芍藥粉末進(jìn)行了顯微鑒定，為藥材的推廣應(yīng)用和鑒定奠定了基礎(chǔ)。采用超聲法提取新疆芍藥總多酚，應(yīng)用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定總多酚的含量，方法操作簡(jiǎn)單，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可作為新疆芍藥質(zhì)控的參考方法，為新疆芍藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。新疆芍藥總多酚的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其對(duì)變異鏈球菌具有一定的體外抑菌活性。針對(duì)齲齒治療藥物的局限性，新疆芍藥總多酚作為潛在的抑菌成分，其抑菌機(jī)制有待于進(jìn)一步研究與探索。