李煥敏，李新民，孫丹，韓耀巍，孫婷，律揚(yáng)，陳鴻祥

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381)

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)為特征的異質(zhì)性疾病，臨床以反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀為主要表現(xiàn)，常在夜間和/或凌晨發(fā)作或加劇。調(diào)查顯示，1990—2015年哮喘的患病率增加12.6%，占據(jù)1.1%的全球疾病負(fù)擔(dān)[1]。哮喘的治療主要通過(guò)吸入糖皮質(zhì)激素和β2受體激動(dòng)劑[2]，二者雖對(duì)哮喘的急性發(fā)作具有重要控制作用，然而緩解期激素類藥物的長(zhǎng)期使用，容易出現(xiàn)副作用，尤其影響兒童患者的生長(zhǎng)發(fā)育。中醫(yī)藥治療哮喘經(jīng)驗(yàn)豐富，很多證據(jù)表明其在治療哮喘時(shí)安全有效[3]，不僅可以緩解哮喘發(fā)作，還能從整體調(diào)節(jié)患者體質(zhì)，增強(qiáng)患者抗病能力，副作用小，故常被單獨(dú)或聯(lián)合用于哮喘緩解期的治療。

《傷寒論》第18條記載“喘家作桂枝湯，加厚樸杏子佳”，指出桂枝加厚樸杏子湯可治療宿有喘病，又感風(fēng)寒而見(jiàn)桂枝湯證者，或風(fēng)寒表證誤用下劑后，表證未解而微喘者。方中厚樸驅(qū)除痰涎，疏利氣雍，杏仁定喘鎮(zhèn)咳，兩者相佐以下氣逆，常被臨床醫(yī)家應(yīng)用于哮喘及咳嗽伴喘息發(fā)作等疾病的治療[4-5]。現(xiàn)代研究表明，厚樸的有效成分厚樸酚能降低哮喘小鼠VEGF的表達(dá)，延緩氣道重構(gòu)的發(fā)生[6]；杏仁的有效成份苦杏仁苷能有效減輕支氣管哮喘小鼠氣管黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[7]。厚樸、杏仁在治療哮喘時(shí)常配伍應(yīng)用，現(xiàn)代藥理學(xué)雖然對(duì)其在治療哮喘中的有效成分有一定研究，但其協(xié)同治療的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性的研究策略與中藥在治療疾病方面的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用原理十分契合。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)厚樸、杏仁配伍應(yīng)用在治療哮喘中的作用途徑和機(jī)制進(jìn)行研究和探討，以期為日后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 中藥化學(xué)成分作用靶標(biāo)及哮喘疾病相關(guān)靶標(biāo)篩選

本研究中厚樸、杏仁的化學(xué)成分及靶標(biāo)信息來(lái)自于中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析平臺(tái)BATMAN-TCM[8](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。將收集整理后的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)[9](https://www.uniprot.org/)列表并限定物種為人，所有靶基因名稱校正為官方名稱(official gene symbol)，并剔除沒(méi)有靶點(diǎn)的活性成分。疾病靶標(biāo)信息來(lái)源于PALM-IST數(shù)據(jù)庫(kù)[10](http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/)。

1.2 韋恩分析及潛在靶標(biāo)信息篩選

應(yīng)用Draw Venn Diagram在線工具[11](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對(duì)厚樸-杏仁(Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum)藥物靶標(biāo)與哮喘疾病靶標(biāo)進(jìn)行韋恩分析。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

采用string數(shù)據(jù)庫(kù)[12](https://string-db.org/cgi/input.pl)對(duì)收集到的藥物靶標(biāo)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network, PPI network)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，設(shè)定最小相互作用得分(interaction score)>0.4進(jìn)行操作，隱藏離散靶點(diǎn)。利用Cytoscape v3.5.1軟件的在線工具Network Analyzer進(jìn)行可視化參數(shù)設(shè)置，通過(guò)cetiscape 2.2插件進(jìn)行連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)分析，篩選關(guān)鍵靶標(biāo)信息。

1.4 基因功能和通路富集分析

利用DAVID (the database for annotation, visualization and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫(kù)[13](https://david.ncifcrf.gov/)和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+cluepedia插件對(duì)藥物關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行GO(gene notology)生物功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 厚樸-杏仁藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)厚樸、杏仁的化合物和靶標(biāo)信息進(jìn)行檢索，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)Score cutoff大于等于40，P≤0.05，剔除不含靶標(biāo)的化合物，分別找到厚樸、杏仁的化合物38個(gè)、16個(gè)；靶標(biāo)353個(gè)、186個(gè)。剔除3個(gè)共有化合物及104個(gè)共有靶標(biāo)，共收集到化合物51個(gè)(見(jiàn)表1)，靶標(biāo)435個(gè)。通過(guò)PALM-IST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)疾病的靶標(biāo)信息進(jìn)行檢索，以“asthma”作為搜索的關(guān)鍵詞，篩選標(biāo)準(zhǔn)為 No. of article大于10，共找到疾病相關(guān)靶標(biāo)415個(gè)。

表1 厚樸-杏仁治療哮喘的藥物有效成分基本信息Table 1 Basic information of effective ingredients of Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.2 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標(biāo)篩選

將厚樸-杏仁靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)信息輸入在線工具Draw Venn Diagram進(jìn)行Venn分析，如圖1所示，其中兩組靶標(biāo)重疊部分共有33個(gè)靶標(biāo)，得到厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標(biāo)，并用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)校正靶標(biāo)名稱和基因ID，如表2所示。

圖1 厚樸-杏仁靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)venn分析Fig.1 Target of Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination and disease target by the Venn analysis

表2 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標(biāo)Table 2 Potential targets for the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

續(xù)表2

2.3 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)string數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)上述33個(gè)厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標(biāo)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中“TYRP1”為離散靶點(diǎn)，以下分析中隱去。采用Cytoscape v3.5.1軟件的在線工具Network Analyzer進(jìn)行可視化參數(shù)設(shè)置，通過(guò)cetiscape 2.2插件選取連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)并選擇“for Undirected Networks”進(jìn)行分析，篩選出厚樸-杏仁治療哮喘的關(guān)鍵靶標(biāo)14個(gè)，分別為ADRB2、CAT、ESR1、F2、IL13、IL1B、INS、MAPK1、PLG、PPARG、TLR4、TNF、TRPV1、VCAM1，如圖2所示。圖中靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)按degree值進(jìn)行大小和顏色調(diào)節(jié)，節(jié)點(diǎn)越大顏色越深，表示degree值越高，其中黃色圓點(diǎn)為離散程度較大的靶標(biāo)。degree值最高的靶標(biāo)為腫瘤壞死因子(TNF)，Ying等[14]研究表明，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中的TNF mRNA增加，提示TNF在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起作用。

圖2 厚樸-杏仁治療哮喘潛在靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.2 PPI network construction of the potential target for the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.4 化合物-潛在靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape v3.5.1軟件對(duì)藥物有效成分和厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標(biāo)進(jìn)行化合物-潛在靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，如圖3所示。網(wǎng)絡(luò)圖中紅色圓形代表化合物，黃色橢圓形代表藥物潛在靶點(diǎn)，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度(degree)表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)，藍(lán)色線條代表化合物與靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)，紫色線條代表基因與基因之間的網(wǎng)絡(luò)?；衔镏谢ㄉ南┧?arachidic acid，AA)有最多的潛在靶標(biāo)(10個(gè))，研究表明，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物半胱氨酸白三烯(cysteinyl leukotrienes，Cys LTs)和脂氧酸(lipoxins，LXs)的不平衡狀態(tài)在哮喘慢性炎癥狀態(tài)中起重要作用。

圖3 化合物-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The compound-potential target network

2.5 厚樸-杏仁治療哮喘關(guān)鍵靶標(biāo)GO生物功能分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+cluepedia插件對(duì)厚樸-杏仁治療哮喘的關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行GO功能分析，其中GO基因功能分析包括生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3部分，并從P<0.05的分析結(jié)果中篩選信息。

2.5.1 厚樸-杏仁治療哮喘的生物學(xué)過(guò)程

厚樸-杏仁治療哮喘的生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)主要涉及應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控、先天性免疫反應(yīng)調(diào)控、防御反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)、刺激反應(yīng)、凝血止血調(diào)節(jié)、自我內(nèi)穩(wěn)定、活性氧代謝過(guò)程、細(xì)胞死亡調(diào)控、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞通訊、創(chuàng)傷修復(fù)、趨化因子產(chǎn)生、蛋白質(zhì)代謝過(guò)程等生物過(guò)程，如表3所示。

表3 厚樸-杏仁治療哮喘的生物學(xué)過(guò)程Table 3 Biological process of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.5.2 厚樸-杏仁治療哮喘的細(xì)胞定位

厚樸-杏仁治療哮喘的細(xì)胞定位(cellular component，CC)主要涉及胞外區(qū)及細(xì)胞外空隙，具體如表4所示。

表4 厚樸-杏仁治療哮喘的細(xì)胞定位Table 4 Cellular component of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.5.3 厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能

厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能(molecular function，MF)主要涉及信號(hào)傳感器活性、信號(hào)受體活性、受體活性、分子傳感器活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體活化的序列特異性DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合等，如表5所示。

表5 厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能Table 5 Molecular function of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.6 厚樸-杏仁治療哮喘關(guān)鍵靶標(biāo)KEGG信號(hào)通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+Cluepedia插件對(duì)厚樸-杏仁治療哮喘的關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，并從P<0.05的分析結(jié)果中篩選信息。

厚樸-杏仁治療哮喘的關(guān)鍵靶標(biāo)主要涉及NF-κB信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、FcεRI信號(hào)通路、Toll受體信號(hào)通路及FoxO信號(hào)通路等，如表6所示。

表6 厚樸-杏仁治療哮喘關(guān)鍵靶標(biāo)KEGG信號(hào)通路Table 6 The KEGG signaling pathway of the key target of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

3 討論

哮喘是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞組分，臨床表現(xiàn)以氣道的慢性炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)為特征。盡管糖皮質(zhì)激素和β2受體激動(dòng)劑可有效控制哮喘癥狀，但長(zhǎng)期使用容易出現(xiàn)副作用，因此仍缺乏治療哮喘的有效方法。目前，在亞洲使用了數(shù)千年的傳統(tǒng)中藥開(kāi)始在西方醫(yī)療保障中作為一種補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)的方式發(fā)揮作用，并且越來(lái)越多的證據(jù)表明中醫(yī)藥治療哮喘的科學(xué)性[15]。哮喘之名出自《丹溪心法·喘論》，屬于中醫(yī)“哮證”“喘證”范疇，其病機(jī)為宿痰伏于肺，復(fù)感外邪引動(dòng)，使痰阻氣道、肺氣上逆而致痰鳴如吼，氣息喘促。厚樸-杏仁入藥歷史悠久，清朝汪昂《本草備藥》中云：“厚樸，苦降能瀉實(shí)滿，辛溫能散濕滿；杏仁，瀉肺、解肌、潤(rùn)燥、下氣”，兩者配伍應(yīng)用“瀉肺平喘，以降氣逆”。本研究的GO基因功能和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，厚樸-杏仁配伍可通過(guò)調(diào)節(jié)多種靶點(diǎn)、生物學(xué)途徑和信號(hào)通路，在哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)等方面發(fā)揮治療作用。

3.1 厚樸-杏仁治療哮喘具有調(diào)節(jié)多靶點(diǎn)、多途徑的潛在作用

(1)調(diào)控炎癥反應(yīng)

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-13(IL-13)和白介素1β(IL1β)是引起哮喘氣道炎癥的重要介質(zhì)。研究顯示，TNF-α能夠增強(qiáng)IL-23調(diào)節(jié)的Th2和Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答[16]，IL-13能夠刺激B細(xì)胞的增殖、分化及IgE的合成，與肥大細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞相互作用，誘發(fā)哮喘的急性發(fā)作[17]，IL1β參與嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥過(guò)程[18]。這些介質(zhì)協(xié)同作用于氣道，引起多種炎癥細(xì)胞的募集活化，促進(jìn)氣道黏液產(chǎn)生和平滑肌收縮，引起氣道重塑和氣道高反應(yīng)。

(2)調(diào)控活性氧代謝

氧化應(yīng)激損傷參與哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，能夠上調(diào)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，增加哮喘的嚴(yán)重程度，促進(jìn)氣道高反應(yīng)和氣道重塑。過(guò)氧化氫酶(CAT)是一種重要的抗氧化酶，其遺傳變異可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞對(duì)抗活性氧，影響哮喘的發(fā)生過(guò)程[19]。

(3)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是機(jī)體普遍表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，幾乎涉及哮喘炎癥網(wǎng)絡(luò)的所有方面，MAPK信號(hào)激活后能夠加速細(xì)胞外信號(hào)傳到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子生成，從而導(dǎo)致氣道炎癥[20]。

(4)調(diào)控受體活性

本研究的關(guān)鍵靶標(biāo)中多種受體參與哮喘的發(fā)生。β2腎上腺素能受體(ADRB2)是G蛋白偶聯(lián)腎上腺素受體家族成員之一，其基因的多態(tài)性與哮喘的易感性、哮喘惡化等方面具有相關(guān)性[21]。雌激素受體(ESR1)可能會(huì)導(dǎo)致哮喘患者的肺功能下降，尤其女性哮喘患者在月經(jīng)期會(huì)出現(xiàn)哮喘癥狀加重[22]。胰島素(INS)抵抗在肥胖相關(guān)的哮喘急性發(fā)作中起作用，可能與胰島素信號(hào)受損，影響葡萄糖的攝入，從而影響抵抗細(xì)菌感染的氣道代謝屏障有關(guān)[23]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)是一種涉及多種細(xì)胞過(guò)程的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞因子表達(dá)和組織重塑[24]。瞬時(shí)受體潛在陽(yáng)離子通道亞家族V成員1(TRPV1)是調(diào)節(jié)CD4+細(xì)胞的激活和炎癥特性重要介質(zhì)，TRPV1抑制劑可減輕IL-13誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道上皮損傷，從而降低哮喘特征[25-26]。激活的Toll樣受體4(TLR4)可以直接或間接影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，從而影響Th1/Th2失衡，其基因多態(tài)性與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)[27]。

(5)調(diào)控凝血止血功能

氣道的慢性炎癥可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，激活血小板和凝血因子，導(dǎo)致凝血功能紊亂。IL-6和較小程度的TNF-α介導(dǎo)的全身性炎癥狀態(tài)，可以驅(qū)動(dòng)血漿中凝血酶原激活片段F1+2(F2)產(chǎn)生增強(qiáng)[28]。纖溶酶原(PLG)在炎性細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用，參與哮喘早期支氣管周圍區(qū)域的膠原沉積和黏液化生，與組織重塑有關(guān)[29]。

3.2 厚樸-杏仁治療哮喘具有調(diào)節(jié)多通路的潛在作用

(1)厚樸-杏仁具有調(diào)節(jié)FcεRI和NF-κB信號(hào)通路的潛在作用

肥大細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)可導(dǎo)致哮喘的發(fā)生，抗原與IgE介導(dǎo)的FcεRI復(fù)合物交聯(lián)激活肥大細(xì)胞，釋放過(guò)敏介質(zhì)及產(chǎn)生各種細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β等)，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[30〗。NF-κB是FcεRI信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，涉及多種炎癥反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)在氣道病理學(xué)中起重要作用[31]。

(2)厚樸-杏仁具有調(diào)節(jié)Toll受體和IL-17信號(hào)通路的潛在作用

Toll樣受體是介導(dǎo)免疫系統(tǒng)識(shí)別病原體的受體家族，病原體通過(guò)Toll樣受體激活氣道上皮的先天性免疫反應(yīng)，并誘發(fā)氣道炎癥，從而導(dǎo)致哮喘急性加重。IL-17在哮喘小鼠模型中高表達(dá)，參與哮喘的氣道炎癥和氧化應(yīng)激過(guò)程[32]。研究表明，IL-17A和TLR3通過(guò)TLR3/TRIF介導(dǎo)的NF-κB/IRF3激活，協(xié)同誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中促炎因子和趨化因子的表達(dá)[33]。

(3)厚樸-杏仁可能具有調(diào)節(jié)FoxO信號(hào)通路的潛在作用

FoxO是一類對(duì)氧化還原敏感的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、氧化應(yīng)激抵抗等生物學(xué)過(guò)程，但目前有關(guān)其在哮喘作用中的研究較少，可能與哮喘的氧化應(yīng)激損傷相關(guān)。

氣道的慢性炎癥是導(dǎo)致哮喘發(fā)生的關(guān)鍵，這種慢性炎癥對(duì)氣道的損害進(jìn)一步引起氣道高反應(yīng)和氣道重塑，以上靶點(diǎn)和通路在哮喘氣道炎癥發(fā)病機(jī)制中起重要作用，也是厚樸-杏仁發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵。因此，厚樸-杏仁治療哮喘具有多靶點(diǎn)、多途徑、多通路的潛在作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在一定程度上揭示了中醫(yī)藥治療哮喘的科學(xué)內(nèi)涵，但尚缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的依據(jù)。