王 歡，所金泉，王春艷，王潤偉

(1.吉林大學公共衛(wèi)生學院，長春 130021；2.吉林大學化學學院，長春130012)

葡萄糖是動植物碳水化合物的主要成分，葡萄糖的定量測定在生命科學中占有重要地位［1，2］，葡萄糖的檢測方法主要有分光光度法、安培法、高效液相色譜法、極譜法和毛細管電泳法等［3］，但多數(shù)方法存在耗時長、檢測費用高等缺點.酶是一類具有較高催化活性的生物催化劑，有較高的底物特異性［4～6］，葡萄糖氧化酶(GOD)可催化β-D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和過氧化氫［7］，酶法檢測葡萄糖具有準確快速、靈敏度高的特點.近年來，葡萄糖氧化酶法已被廣泛用于生物化學、臨床化學及食品分析中葡萄糖的檢測［8～10］，酶在正常條件下表現(xiàn)出很高的選擇性和反應性，但對pH 和溫度較敏感而易失活［11］，游離酶價格昂貴且使用一次后不能回收利用，增加了檢測成本.酶的固定化在很大程度上能夠解決上述問題，固定化GOD 用于檢測葡萄糖含量具有反應時間短、保存期較長、靈敏度高及反應快捷等優(yōu)點［12，13］.酶固定化方法有物理法和化學法2 大類［14］，其中物理法包括吸附法和包埋法；化學法包括共價結(jié)合法和交聯(lián)法等［15］.二氧化硅由于本身無毒，具有化學和生物惰性，而成為一種優(yōu)良的酶固定化載體.Balistreri 等［16］通過偶聯(lián)脂質(zhì)體囊泡將葡萄糖氧化酶GOD 固定在仿生二氧化硅顆粒中，用仿生硅化過程模擬細胞微環(huán)境，GOD 的回收率達到71.8%，固定化GOD 的熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性均有所提高，也顯著改善了其耐受性和可重復使用性.因此，尋找一種能夠提高酶活保留率以及重復使用次數(shù)的酶固定化載體是工作的重點.

樹枝狀介孔二氧化硅納米材料(DMSNs)是一種具有特殊形貌的酶固定化載體.DMSNs 比傳統(tǒng)的介孔二氧化硅材料有如下優(yōu)勢: (1) 整體形貌為樹枝狀，開放性較好，內(nèi)有樹枝狀空腔，存在10 ～25 nm的內(nèi)部外部堆積孔；(2) 可調(diào)控性強，由于表面含有裸露的硅羥基，可與功能化硅烷縮合，形成具有功能基團(巰基、氨基或羧基)的表面，且其粒徑和孔徑尺寸等可調(diào)；(3) 材料穩(wěn)定性較高，不易被破壞；(4) 較大的比表面積可以提高酶的蛋白載量.上述性能說明DMSNs 是一種優(yōu)良的酶固定化載體，目前，關(guān)于3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)修飾樹枝狀介孔二氧化硅的研究鮮有文獻報道.

本文利用APTES 對DMSNs 材料進行氨基修飾，合成了氨基化樹枝狀介孔二氧化硅納米粒子(DMSNs-NH2)；并用此材料作為載體制備了固定化GOD(DMSNs-NH2-GOD).考察了固定GOD 時酶濃度和固定時間對固定效果的影響，研究了固定化GOD 的酶學性質(zhì)，利用固定化GOD 進行了葡萄糖的定量檢測.該方法具有靈敏度高、檢測快速及重復利用率高等特點，最低檢測限為0.0014 mg/mL，20 min即可完成樣品中葡萄糖的檢測.固定化GOD 可用于重復檢測血清，使用36 次后酶活性仍大于80%；將固定化GOD 用于檢測飲料中的葡萄糖，重復使用41 次后酶活性仍大于80%.該研究解決了現(xiàn)有固定化技術(shù)存在的酶浪費問題，降低了檢測成本，固定化酶的pH 穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均顯著高于游離酶，拓寬了固定化酶的研究領(lǐng)域.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

葡萄糖氧化酶(GOD)、辣根過氧化物酶(HRP)、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒、三乙胺(TEA)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)購于Solarbio 科技有限公司；鄰聯(lián)茴香胺購于Macklin 公司；葡萄糖、無水乙酸鈉和冰乙酸購于北京化工廠；正硅酸乙酯(TEOS，純度98%)和濃氨水(NH3·H2O，質(zhì)量分數(shù)28%)購于國藥集團化學試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)購于惠世生物試劑公司；實驗所用試劑均為分析純，超純水為實驗室自制.

TecnaiG2 F20s-twin D573 型場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM，美國FEI 公司)；VERTEX 80v 型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，美國 Bruker 公司)；Rigaku D/Max 2550X/PC 型 X 射線衍射儀(XRD，日本理學公司)；JSM-6700F 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM，日本 JEOL 公司)；STA 449C 型差熱-熱重分析儀(德國Netzsch 公司)；多功能微孔板監(jiān)測儀-酶標儀(美國Bio-Rod 伯樂公司)；Allegra X-30R 型離心機(美國貝克曼庫爾特公司).

1.2 實驗過程

1.2.1 DMSNs-NH2的合成 將0.68 g TEA 和20 mL 超純水加入到100 mL 燒杯中，于80 ℃水浴30 min；再加入 0.38 g CTAB 和 0.16 g 水楊酸鈉，于 80 ℃水浴 30 min；快速加入 4 mL TEOS，于 80 ℃水浴 2 h，離心，用超純水和乙醇各洗滌 2 次，置于 80 ℃烘箱干燥整夜.取 0.30 g 上述材料，加入60 mL 乙醇和 0.77 mL 濃鹽酸，水浴 6 h，離心后用乙醇清洗 2 次，置于 80 ℃ 烘箱干燥，研磨，即得DMSNs.

將0.50 g DMSNs 加入到盛有100 mL 甲苯的圓底燒瓶中，于80 ℃加熱至澄清后，加入0.5 mL APTES，于 80 ℃加熱回流 4 h，離心，沉淀用甲苯清洗 2 次，干燥過夜，經(jīng)研磨后得到 DMSNs-NH2.

1.2.2 DMSNs-NH2固定化GOD 將10.0 mg DMSNs-NH2加入到10 mL GOD 溶液中，于4 ℃冰浴條件下勻速攪拌進行酶的固定.將混懸液離心，沉淀經(jīng)冷凍干燥即得固定化GOD(DMSNs-NH2-GOD)，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；上層清液采用Bradford 法測定蛋白濃度［17］.分別改變酶固定過程中的酶濃度(0.1～0.6 mg/mL)和酶固定時間(4～12 h)，其它條件不變，在4 ℃條件下勻速攪拌，考察其對GOD蛋白載量及活性的影響.

1.2.3 固定化酶性質(zhì)測定 采用文獻［18］方法測定固定化GOD 和游離GOD 的活性.向由5.0 mL 鄰聯(lián)茴香胺-甲醇緩沖液、0.6 mL 18%葡萄糖溶液、0.2 mL 0.03%HRP 溶液和0.2 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=5.0)的混合溶液中，分別加入一定體積的固定化GOD 和游離GOD，于35 ℃反應3 min 后，迅速加入3% H2SO4溶液各2 mL 終止反應.空白對照是加入同體積煮沸去活的酶液作為對比，其它條件均相同.用紫外-可見分光光度計測定上層清液在460 nm 處的吸光度值，計算GOD 活性.酶活性(U/g)定義: 35 ℃時，每分鐘氧化1.0 μmolβ-D-葡萄糖為D-葡萄糖酸內(nèi)酯和過氧化氫的酶量為一個酶活單位.按照上述酶活性的測定方法，以相對酶活性為參考指標，測定固定化GOD 和游離GOD 的最適pH、最適溫度、pH 穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性.

1.2.4 固定化GOD 檢測實際樣品及重復使用性 對檢測條件進行了優(yōu)化，確定了最佳檢測時間和固定化GOD 加入量.采用建立的檢測方法對不同濃度(0.001 ～0.500 mg/mL)的葡萄糖標準溶液進行檢測，測定上層清液的吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，經(jīng)計算得出檢出限.

血液樣本經(jīng)離心后得到血清，稀釋10 倍后備用；含有葡萄糖的果汁飲料樣本經(jīng)過濾稀釋100 倍備用.在樣品管中加入3.0 mg 固定化GOD，3.0 mL 顯色液，0.5 mL 超純水和0.5 mL 待測稀釋液，每個樣品設3 個平行樣，空白對照不加固定化GOD，其它均相同，于40 ℃反應20 min，離心后測定上層清液在505 nm 處的吸光度值，經(jīng)計算得出實際樣品中的葡萄糖濃度，并與游離酶檢測結(jié)果進行對比.每次檢測完成后，離心分離并洗滌固定化GOD，再進行重復使用，將第一次使用時的固定化GOD 活性視為100%，之后每次的活性用與第一次對比后保留的活性表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 DMSNs-NH2 的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 形貌表征 圖1(A)和(B)分別為DMSNs-NH2的SEM 和TEM 照片.由圖1(A)可見，該材料分散性較好，粒徑約為200 nm.圖1(B)表明，材料有褶皺狀孔道直通內(nèi)部，呈樹枝狀，皺襞較薄，整體開放性較好，可為酶的固定化提供更多的空間.

Fig.1 SEM(A) and TEM(B) images of DMSNs-NH2

2.1.2 紅外光譜分析 對GOD，DMSNs-NH2及DMSNs-NH2-GOD 進行了紅外光譜分析.由DMSNs-NH2的紅外光譜圖(圖2 譜線c)可見，1088 cm－1處有 1 個較寬的 Si—O 鍵吸收峰［19］，2827 和 2960 cm－1處的峰為亞甲基的C—H 鍵伸縮振動峰，1636 cm－1處有—NH2的振動峰，表明氨基已修飾到DMSNs上［20］.GOD 的紅外光譜圖(圖2 譜線a)上，1646 和1526 cm－1處的峰分別為酰胺Ⅰ鍵和酰胺Ⅱ鍵的吸收峰，DMSNs-NH2-GOD 的紅外光譜圖(圖2 譜線b)上也有相同的峰，說明GOD 已固定在DMSNs-NH2上［21～23］.

Fig.2 FTIR spectra of GOD(a)，DMSNs-NH2-GOD(b) and DMSNs-NH2(c)

Fig.3 XRD patterns of DMSNs(a)，DMSNs-NH2(b) and DMSNs-NH2-GOD(c)

2.1.3 XRD 分析 圖3 為 DMSNs，DMSNs-NH2和 DMSNs-NH2-GOD 的 XRD 譜圖.可見，3 個樣品均在2θ=23°處出現(xiàn)非晶面衍射峰，說明樣品為無定形SiO2，樹枝狀介孔二氧化硅經(jīng)過氨基修飾和加載GOD后，并未對結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.

2.1.4 氣體吸附性能 由圖4 可知，DMSNs-NH2和DMSNs-NH2-GOD 的N2吸附-脫附曲線是典型的Ⅳ型曲線，曲線后端存在1 個H3 型滯后環(huán)，表明DMSNs-NH2為介孔材料.利用BET 法和BJH 法計算得出DMSNs-NH2的比表面積和孔容分別為215.19 m2/g 和0.88 cm3/g，DMSNs-NH2-GOD 的比表面積和孔容分別為165.06 m2/g 和0.64 cm3/g，表明 GOD 已經(jīng)固定在該載體上.在相對壓力(p/p0)為0.1～0.8 范圍內(nèi)，曲線較平緩，這是因為氮氣分子以單層吸附在孔道表面；在相對壓力為0.8 ～1.0時，有一個明顯的突躍，這是由于氮氣在材料孔道中發(fā)生毛細凝聚所致.由圖4 插圖可見，材料孔徑主要集中在約25 nm，孔徑均勻.以上結(jié)果表明，DMSNs-NH2的比表面積和孔容均較大，有利于酶的固定［24，25］.

Fig.4 N2 adsorption-desorption isotherms and pore size distribution plots (inset) of DMSNs-NH2 (a)(translate up 100) and DMSNs-NH2-GOD(b)

2.1.5 熱重分析 對樣品進行了熱重分析(TGA)，空氣氣氛，升溫速率為10 ℃/min，溫度范圍為25～800 ℃.如圖5 所示，當溫度升高后，2 個樣品均在25～110 ℃和320～650 ℃區(qū)間出現(xiàn)了2 個失重階段，分別是由水和氨丙基的失去引起的；當溫度達到800 ℃時，DMSNs-NH2質(zhì)量共損失15%，而DMSNs-NH2-GOD 質(zhì)量損失達27%，說明從DMSNs-NH2-GOD 到DMSNs-NH2又損失了12%，該差值是由固定在DMSNs-NH2上的GOD 產(chǎn)生的，進一步說明GOD 已固定在DMSNs-NH2材料上.

2.2 GOD 固定條件的優(yōu)化

考察了固定GOD 時酶濃度和固定時間的影響.測定了不同濃度GOD 溶液固定時的蛋白載量和酶活性，結(jié)果如圖6(A)所示，當酶濃度較低時，蛋白載量和酶活性均隨著酶濃度的增大而逐漸增加，且酶活性在酶濃度為0.30 mg/mL 時達到最大，此時載體上的氨基與酶分子表面的羧基結(jié)合；當酶濃度繼續(xù)增加時，載體上酶分子的量達到飽和，產(chǎn)生了空間位阻與擴散阻力，酶活性受到了抑制［26］，因此，GOD 固定的最適酶濃度為0.30 mg/mL.測定了不同固定時間下GOD 的蛋白載量，結(jié)果如圖6(B)所示，GOD 的蛋白載量隨著固定時間的延長逐漸增加，并在6 h 達到飽和狀態(tài).初步研究［27］表明，酶負載量過大會降低酶的遷移率，多層吸附會阻斷酶的活性位點.因此，最適宜固定時間為6 h，最適宜酶濃度為0.30 mg/mL.

Fig.6 Optimum concentration(A) and immobilization time(B) for GOD immobilization

2.3 固定化GOD 的性質(zhì)

2.3.1 固定化GOD 的pH 穩(wěn)定性 分別將游離GOD 與固定化GOD 置于pH=2.0～7.0 的緩沖液中2 h后，測定酶活性.如圖7(A)所示，游離GOD 在pH=3.5 ～4.5 范圍內(nèi)活性較高，而在偏酸和偏堿性環(huán)境下，活性顯著下降.固定化GOD 在pH=2.0～6.0 范圍內(nèi)活性較高，在pH=5.0 時達到最大酶活，當pH＞6.0 時，固定化GOD 的相對酶活性剩余75%以上，而游離GOD 僅剩余55%.由于酶分子被固定在載體內(nèi)部，樹枝狀孔隙結(jié)構(gòu)對酶形成了保護，與游離GOD 相比，固定化GOD 更耐酸堿，pH 穩(wěn)定性更好.

Fig.7 pH stability(A) of immobilized enzyme(a) and free enzyme(b) and thermal stability of immobilized enzyme and free enzyme(B)

2.3.2 固定化GOD 的熱穩(wěn)定性 分別將游離GOD 和固定化GOD 置于50 和60 ℃水浴箱中保存2.5 h后測定酶活.由圖7(B)可見，在50 ℃下保存2.5 h 后，固定化GOD 酶的活性僅減少10%，而游離GOD 酶活性減少了20%；在60 ℃下保存2.5 h 后，固定化GOD 酶活性剩余75%，保留了較高的相對酶活性，而游離GOD 酶活性僅剩57%.其原因是高溫會加速熱運動，而酶的催化作用與蛋白的四級結(jié)構(gòu)有關(guān)，當溫度過高時，自由酶不能保持穩(wěn)定的催化構(gòu)象，而固定化GOD 的載體則可有效抑制酶蛋白的過度運動，從而減緩了高溫對酶催化活力的影響，降低了高溫引起的酶分子變性.由此可知，GOD 經(jīng)過固定化后熱穩(wěn)定性得到了顯著改善［28］.

2.3.3 固定化GOD 的儲存穩(wěn)定性 將固定化GOD 儲存在4 ℃冰箱中，每周定期抽取一批樣品，比較游離GOD 與固定化GOD 的儲存穩(wěn)定性.結(jié)果如圖8所示，儲存 2 個月后，固定化GOD 酶活性剩余93%，而游離GOD 酶活性僅剩余76%，表明 GOD 經(jīng)過固定后，儲存穩(wěn)定性得到了提高.

Fig.8 Storage stability of immobilized enzyme(a)and free enzyme(b)

2.4 固定化GOD 的應用

2.4.1 葡萄糖檢測條件的優(yōu)化 考察了固定化GOD 檢測葡萄糖時檢測時間和固定化GOD 加入量對檢測的影響.將固定化GOD 與葡萄糖底物溶液(0.1 mg/mL)反應不同時間測定吸光度值，結(jié)果表明，當反應時間為20 min 時，底物反應完全，因此檢測的最佳反應時間為20 min.用不同含量的固定化GOD檢測葡萄糖底物溶液(0.1 mg/mL)，當固定化GOD 加入量為3.0 mg 時底物反應完全，故選擇最佳固定化GOD 的加入量為3.0 mg.

2.4.2 葡萄糖檢出限的確定 配制一系列不同濃度的葡萄糖標準溶液，用固定化GOD 對其進行檢測.結(jié)果如圖9 所示，隨著葡萄糖含量的增大，吸光度值增加，二者在0.001～0.500 mg/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=4.9883x+0.0025，R2=0.9987，檢出限為 0.0014 mg/mL.

2.4.3 實際樣本檢測和重復使用性 采用本文方法對4 份血清樣本(來自4 名志愿者)進行了檢測.血樣于4 ℃經(jīng)離心得到血清，稀釋10 倍，用固定化GOD 對其進行檢測，每個樣品設3 個平行樣，并與游離GOD 檢測方法進行對比，結(jié)果如表1 所示.經(jīng)統(tǒng)計分析，P值均大于0.05，說明2 種檢測方法無顯著性差異，檢測結(jié)果可靠.圖10(A)顯示，固定化GOD 用于重復檢測血清，使用36 次后，酶活性仍大于80%，說明測方法重復使用性較好，可用于臨床血樣分析.

Fig.9 Linear equation for determination of glucose

Table 1 Results of serum detection by GOD and DMSNs-NH2-GOD(n=3)

Fig.10 Reusability of immobilized enzymes in detecting serum(A) and drinks samples(B)

將市售果汁飲料樣本過濾后，取1 mL 濾液置于100 mL 容量瓶中，用超純水稀釋至刻度后混合均勻，備用.采用本文方法進行檢測，每個樣品設3 個平行樣，并與游離GOD 檢測結(jié)果(國標法［29］)進行對比.結(jié)果表明，固定化GOD 檢測所得葡萄糖濃度為(19.884±0.213) mg/mL，游離GOD 檢測所得葡萄糖濃度為(20.172±0.169) mg/mL ，經(jīng)統(tǒng)計學分析，T=－1.415，P=0.293，說明 2 種檢測方法無顯著性差異.檢測完成后，固定化GOD 經(jīng)緩沖液清洗后可重復進行檢測，由［圖10(B)］可見，固定化GOD 重復使用41 次后酶活性仍大于80%.

3 結(jié) 論

合成了氨基修飾的樹枝狀介孔二氧化硅納米粒子(DMSNs-NH2)，利用其對葡萄糖氧化酶(GOD)進行了固定化研究.建立了應用固定化GOD 檢測葡萄糖的方法，并對臨床樣本和食品樣本進行了檢測分析.結(jié)果表明，固定化GOD 能夠準確檢測血清及飲料中的葡萄糖含量，具有高穩(wěn)定性、高重復性、高催化活性及不受其它物質(zhì)干擾的特點；固定化GOD 用于檢測血清樣品時，重復使用36 次后仍保持80%以上的活性.