任玉雙，郭園園，劉學(xué)怡，宋 杰，張 川

（1.上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,上海交通大學(xué)變革性分子前沿科學(xué)中心,金屬基復(fù)合材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.電子信息與電氣工程學(xué)院,上海200240）

全球范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重威脅人類健康，尤其乳腺癌已經(jīng)成為全球女性發(fā)病率和致死率最高的癌癥之一［1～3］.廣譜性抗癌藥順鉑廣泛用于包括乳腺癌在內(nèi)的實(shí)體瘤的治療中［4］.然而小分子順鉑藥物具有溶解性差，體內(nèi)半衰期短，選擇性差以及劑量毒副作用等缺點(diǎn)，嚴(yán)重限制了其治療的有效性［5～8］.近幾十年來，研究人員一直致力于研發(fā)療效好且副作用小的新型鉑類藥物以用于治療乳腺癌等癌癥［9～11］.但二價(jià)順鉑復(fù)合物固有的易與血液中含硫物質(zhì)結(jié)合失活和無靶向性等缺點(diǎn)，使其在生物利用度和安全性方面仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)［12，13］.

在鉑類藥物發(fā)展過程中，四價(jià)順鉑類［Pt（Ⅳ）］前藥復(fù)合物具有毒性低和藥理學(xué)良好的特征，展現(xiàn)了很好的應(yīng)用前景.八面體Pt（Ⅳ）前藥在血漿中具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性和穩(wěn)定性，且進(jìn)入癌細(xì)胞便會在細(xì)胞內(nèi)源性還原劑作用下激活，釋放出活性的二價(jià)順鉑類藥物以抑制腫瘤生長［14，15］.八面體Pt（Ⅳ）前藥在Pt配位中心有2個(gè)可調(diào)節(jié)的軸向配體，通過設(shè)計(jì)調(diào)整軸向配體基團(tuán)可以精確調(diào)節(jié)復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性、氧化還原電勢、親脂性和生物活性等性質(zhì)［16］.此外，軸向位置還可設(shè)計(jì)靶向性功能分子或連接性功能分子將其負(fù)載到納米輸送載體上［17～19］，以增加藥物對腫瘤細(xì)胞的特異性識別，促進(jìn)細(xì)胞攝取［20，21］.Pt（Ⅳ）前藥連接腫瘤靶向分子以形成靶向藥物，可以提高藥物療效并減少副作用.乳腺癌等大多數(shù)腺癌細(xì)胞表面都會過度表達(dá)MUC-1 蛋白，因此MUC-1 蛋白可作為抗癌藥物遞送的有效靶標(biāo)，在此基礎(chǔ)上研發(fā)出了可以特異性結(jié)合MUC-1蛋白的靶向分子MUC-1適配體［22］.MUC-1適配體是一段含有25個(gè)堿基序列的核苷酸，已廣泛應(yīng)用于腫瘤靶向藥物策略研究［23，24］.將Pt（Ⅳ）前藥與MUC-1適配體結(jié)合，則可構(gòu)建出具有主動(dòng)靶向功能的新型藥物遞送系統(tǒng)并用于腫瘤治療.

納米藥物遞送體系常用的載體包括脂質(zhì)體［25～27］、聚合物膠束［28］及無機(jī)納米材料等［29］.然而，大多數(shù)納米藥物載體生物相容性并不理想，可能引發(fā)強(qiáng)烈的副作用，如線粒體損傷、血小板聚集、炎癥和氧化應(yīng)激等［30～32］.因此，構(gòu)建具有良好生物相容性以及更高效的靶向藥物系統(tǒng)遞送順鉑類藥物，對提高藥物生物利用率，增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果以及降低其系統(tǒng)毒副作用具有重要意義.DNA自組裝納米材料具有良好的生物相容性，可以實(shí)現(xiàn)藥物的修飾負(fù)載和高效靶向遞送，在藥物遞送領(lǐng)域顯示了巨大的潛力［33～40］.DNA材料具有低免疫原性，生物可降解且組裝結(jié)構(gòu)精確可控，在生理環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性，其納米結(jié)構(gòu)能夠很好地促進(jìn)細(xì)胞攝?。?3］.基于DNA納米結(jié)構(gòu)的藥物輸送體系負(fù)載藥物的方式包括DNA雙鏈插入法［34］、核酸雜交法［35，36］及化學(xué)反應(yīng)結(jié)合法［37～40］等.目前，大多數(shù)DNA藥物化學(xué)偶聯(lián)方法依賴于其端基氨基或硫醇修飾來反應(yīng)接枝藥物，該方法的載藥率低、合成繁瑣及成本高.最近，我們［41，42］發(fā)展了一種基于硫代核酸骨架上的硫代磷酸酯（PS）基團(tuán)接枝小分子藥物的新型載藥方法，其硫代核酸可通過固相合成方法直接制備，簡單方便，而且其硫代核酸骨架上硫代修飾位點(diǎn)和數(shù)量可調(diào)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥物分子接枝位點(diǎn)和數(shù)量的精確調(diào)控，提高藥物載藥率.

本文設(shè)計(jì)合成了含MUC-1適配體序列并接枝了Pt（Ⅳ）前藥的兩親性核酸-順鉑前藥綴合物，并通過自組裝進(jìn)一步構(gòu)建了新型含鉑DNA納米藥物遞送系統(tǒng).在細(xì)胞以及動(dòng)物層面對其靶向遞送特性和抗腫瘤效果進(jìn)行了評價(jià).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

順鉑（cis-Platin，分析純）購自大連美倫生物技術(shù)有限公司；過氧化氫（H2O2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、碘代乙酸酐和苯甲酸酐（分析純）及Alexa fluor?488/Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷均為分析純，購自上海泰坦科技有限公司；所有硫代DNA均購自上海百易基因科技有限公司；所有寡核苷酸的序列列于表S1（見本文支持信息）.

MERCURY plus 400型核磁共振波譜儀（NMR，美國Varian公司）；Evolution 300型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，美國ThermoFisher 公司）；ZS90 型納米粒度及Zeta電位分析儀（DLS，英國Malvern 公司）；BD LSRFortessa 型流式細(xì)胞儀（FCM，美國BD公司）；TCS SP8 STED 3X型活細(xì)胞超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡（CLSM，德國Leica 公司）；Synergy H4 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；Tecnai G2 Spirit Biotwin型透射電子顯微鏡（TEM，美國FEI 公司）.

1.2 MUC-1/Pt-SNA納米藥物的合成

1.2.1 Pt（Ⅳ）前藥cis，cis，trans-［Pt（NH3）2Cl2（CO2C6H5）（CO2CH2I）］（簡稱 Pt-Bz-CH2I，3）的合成 如Scheme 1和圖S1（見本文支持信息）所示，參照文獻(xiàn)［43］方法合成了氧化順鉑（1），并合成cis，cis，trans-［Pt（NH3）2Cl2（CO2C6H5）OH］（簡稱 Pt-Bz，2）.首先將 100 mg（300 μmol）的氧化順鉑與 30 mL 的超干DMSO 攪拌混懸均勻，再緩慢加入74.6 mg（330 μmol）的苯甲酸酐，室溫下避光反應(yīng)過夜.將反應(yīng)液通過硅藻土過濾以除去未反應(yīng)的氧化順鉑，收集濾液直接真空凍干.分別用DMF（1×5 mL）和丙酮（3×5 mL）洗滌凍干后的產(chǎn)物，并經(jīng)真空干燥得到白色粉末產(chǎn)物2，產(chǎn)率為60.2%.由圖S2（見本文支持信息）可見，化合物2的1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：7.87（d，2H，arom H），7.48（t，1H，arom H），7.38（t，2H，arom H），6.04（m，6H，NH3）.Pt-Bz 的ESI-MS 結(jié)果如圖S3（見本文支持信息）所示，［M+H］+為436.9760，與C7H12Cl2N2O3Pt理論分子量436.9873一致.

Scheme 1 Schematic illustrations of MUC-1/PODNA-b-(PSDNA-g-Pt) conjugate synthesis and the self-assembly of MUC-1/Pt-SNAs

參照文獻(xiàn)［44］方法合成Pt（Ⅳ）前藥化合物（Pt-Bz-CH2I，3）.首先將100 mg（228 μmol）的化合物2與10 mL的超干DMF混懸均勻，在冰浴環(huán)境下緩慢加入403.4 mg（1140 μmol）的碘代乙酸酐，繼續(xù)避光反應(yīng)12 h.將反應(yīng)后的溶液過濾，并凍干濾液，分別用二氯甲烷（1×2 mL）和乙醚（5×10 mL）洗滌凍干產(chǎn)物，干燥得到灰色固體產(chǎn)物Pt-Bz-CH2I，產(chǎn)率71.4%.由圖S4（見本文支持信息）可見，Pt-Bz-CH2I 的1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：7.87（d，2H，arom H），7.51（t，1H，arom H），7.43（t，2H，arom H），6.64（m，6H，NH3），3.82（s，2H，—CH2I）.Pt-Bz-CH2I 的ESI-MS 結(jié)果如圖S5（見本文支持信息）所示，［M+H］+為606.9022，與C9H14Cl2IN2O4Pt的理論分子量606.9101一致.

1.2.2 DNA接枝Pt(Ⅳ)前藥綴合物MUC-1/PODNA-b-(PSDNA-g-Pt)的合成 將Pt-Bz-CH2I溶解在超干DMF中，然后添加DMF溶解的硫代DNA（MUC-1-POT2-PST20-T）溶液，反應(yīng)物的投料比（即Pt-Bz-CH2I與DNA中PS基團(tuán)個(gè)數(shù)比）為30∶1，反應(yīng)液中DNA的濃度為60 OD/mL，將混合物在55 ℃下避光震蕩反應(yīng)36 h.將反應(yīng)后的產(chǎn)物裝進(jìn)截留分子量為5000的透析袋并置于DMSO中透析2 d，每4 h換一批新鮮DMSO，以除掉未反應(yīng)的Pt（Ⅳ）前藥.取出透析袋內(nèi)的溶液真空干燥，得到兩親性核酸-順鉑前藥綴合物MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）.

1.2.3 MUC-1/Pt-SNAs的自組裝 將合成的MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）溶解在0.3 mL DMSO中，加下0.3 mL水并充分混合均勻，經(jīng)超純水透析1 d以除去DMSO，最終自組裝形成類似球形核酸（SNA）的納米藥物MUC-1/Pt-SNAs（Scheme 1）.通過20%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Poly-acrylamide gel electrophoresis，PAGE）和1.5%瓊脂糖凝膠電泳表征MUC-1/Pt-SNAs的合成組裝.

1.3 MUC-1/Pt-SNA納米藥物體外靶向效果和抗腫瘤效果測試

1.3.1 MUC-1/Pt-SNAs納米藥物的細(xì)胞攝取行為 實(shí)驗(yàn)選用過表達(dá)MUC-1蛋白的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞（MUC-1+）和陰性對照組肝癌HepG 2細(xì)胞（MUC-1-），探究了MUC-1/Pt-SNAs納米藥物的靶向效果.所有細(xì)胞均在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng).

通過流式細(xì)胞儀表征MCF-7（MUC-1+）和HepG 2（MUC-1-）細(xì)胞對MUC-1/Pt-SNA 納米藥物的攝取行為.將MCF-7 和HepG 2 細(xì)胞分別以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在24 孔板中，細(xì)胞貼壁后換用Opti 培養(yǎng)基，分別向細(xì)胞中添加熒光分子Cy5 標(biāo)記的free Cy5-MUC-1 DNA 和Cy5-MUC-1/Pt-SNA 樣品（Cy5濃度為0.2 μmol/L）.孵育不同時(shí)間后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析.

通過共聚焦激光掃描顯微鏡表征Cy5-MUC-1/Pt-SNAs的細(xì)胞攝取.將MCF-7和HepG 2細(xì)胞分別以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到底部放置了干凈的小蓋玻片的24孔板中，分別向細(xì)胞中添加熒光分子Cy5 標(biāo)記的 free Cy5-MUC-1 DNA 和Cy5-MUC-1/Pt-SNA 樣品（Cy5 濃度為0.2 μmol/L）.孵育一定時(shí)間后，用Hoechst 33342將細(xì)胞核染色，用于共聚焦激光掃描顯微鏡觀察.

1.3.2 MUC-1/Pt-SNAs納米藥物的細(xì)胞毒性 將MCF-7和HepG 2細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中，分別加入不同濃度梯度的MUC-1/Pt-SNAs、Pt（Ⅳ）前藥和順鉑藥物，培養(yǎng)72 h后，通過MTT 試劑評價(jià)細(xì)胞活性.每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度條件下做5個(gè)平行樣品.

1.3.3 MUC-1/Pt-SNAs 納米藥物的細(xì)胞凋亡 首先將MCF-7細(xì)胞以每孔3×104個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種于24 孔板中，分別加入含等量鉑濃度（60 μmol/L）的MUC-1/Pt-SNAs、Pt（Ⅳ）前藥和順鉑藥物，孵育72 h 后，采用細(xì)胞凋亡試劑盒（分別用Alexa fluor?488 annexin V 和PI 染色）測定MCF-7 腫瘤細(xì)胞凋亡情況.

1.4 MUC-1/Pt-SNA納米藥物動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤效果分析

給每只35 d 左右大的Balb/c 雌性裸鼠皮下注射0.2 mL 含4×106個(gè)MCF-7 細(xì)胞的細(xì)胞懸液，構(gòu)建MCF-7皮下腫瘤模型.待腫瘤體積增長到50 mm3左右時(shí)，將荷瘤裸鼠按照每組3只隨機(jī)分成3組，分別注射磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、順鉑藥物以及MUC-1/Pt-SNAs藥物（其中順鉑含量均為4 mg/kg），每隔3 d給藥，共計(jì)給藥5次.每次給藥時(shí)分別對裸鼠拍照，并記錄每組裸鼠的體重以及皮下腫瘤的長（L，mm）和寬（W，mm）.腫瘤體積（V，mm3）的計(jì)算公式為V=1/2×L×W2.給藥15 d 后，處死裸鼠，解剖取出心、肝、脾、肺、腎和腫瘤，進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫熒光分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 含鉑DNA納米藥物的設(shè)計(jì)

以48 個(gè)堿基的硫代嵌段DNA MUC-1-POT2-PST20-T 為載體，將其5′端設(shè)計(jì)為普通磷酸酯鍵（Phosphodiester，PO）且具有靶向功能的MUC-1適配體序列（MUC-1/PODNA），中間引入2個(gè)普通T堿基作為間隔序列（POT2），同時(shí)將其3′端設(shè)計(jì)為20 個(gè)硫代磷酸酯基團(tuán)（PSDNA）修飾的純T 堿基（PST20-T），用于接枝Pt（Ⅳ）前藥，最終形成兩親性核酸-順鉑前藥綴合物MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）.該綴合物在水溶液中可進(jìn)一步自組裝形成類似于球形核酸的納米藥物MUC-1/Pt-SNAs.由于核酸適配體的引入，組裝的球形核酸納米藥物可實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向功能，

2.2 MUC-1/Pt-SNAs納米藥物的表征

將硫代DNA 接枝Pt（Ⅳ）前藥后，得到綴合物MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）.產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別通過ICP測出其中Pt（Ⅳ）前藥的含量，以及通過紫外分光光度儀測量其中硫代DNA的含量，可以得出藥物中Pt（Ⅳ）前藥的接枝率和載藥率.為避開Pt（Ⅳ）前藥影響，采用端基修飾了熒光分子Cy5的DNA（Cy5-MUC-1-POT2-PST20-T）（表S1，見本文支持信息）以及其綴合物Cy5-MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）在654 nm 處的紫外吸收強(qiáng)度來定量DNA.如圖S6（見本文支持信息）所示，計(jì)算出綴合物Cy5-MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）中的Pt（Ⅳ）前藥和嵌段DNA的摩爾比（即藥物接枝比）約為20，和此嵌段DNA上設(shè)計(jì)20 個(gè)硫代磷酸酯基團(tuán)反應(yīng)位點(diǎn)相對應(yīng)，由此計(jì)算得到其載藥率約為39.6%.結(jié)果表明，MUC-1-POT2-PST20-T載藥體系能夠通過其硫代DNA骨架上硫代磷酸酯基團(tuán)高效接枝載送順鉑前藥，從而提高了順鉑藥物的載藥率.

如圖1（A）所示，對比DNA反應(yīng)前后的20%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）結(jié)果可見，硫代DNA接枝Pt（Ⅳ）前藥反應(yīng)后產(chǎn)物堵在膠孔中，說明綴合物MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）結(jié)合成功.由于DNA具有高度親水性，而Pt（Ⅳ）前藥具有疏水性，因此在硫代DNA片段上大量接枝Pt（Ⅳ）前藥形成了兩親性核酸-順鉑前藥綴合物MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt），并可以親疏水自組裝成球形核酸納米藥物MUC-1/Pt-SNAs.通過臨界膠束濃度（Critical micelle concentration，CMC）可評價(jià)其自組裝能力.采用包載熒光探針尼羅紅方法測定MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）的臨界膠束濃度.如圖2（A）所示，尼羅紅熒光強(qiáng)度隨MUC-1/PODNA-b-（PSDNA-g-Pt）水溶液濃度的變化而變化，其拐點(diǎn)處濃度為0.23 μmol/L，即為MUC-1/Pt-SNA納米藥物的CMC.結(jié)果表明MUC-1/Pt-SNAs納米藥物具有較低的CMC，能夠很容易在水中親疏水自組裝，并初步體現(xiàn)了MUC-1/Pt-SNAs具有較高的組裝穩(wěn)定性.

Fig.1 Characterizations of MUC-1/PODNA-b-(PSDNA-g-Pt)and its self-assembled MUC-1/Pt-SNAs

MUC-1/Pt-SNAs 組裝結(jié)果如圖1（B）所示，MUC-1/Pt-SNA 樣品浸入1.5%的瓊脂糖凝膠中，并顯示為清晰的均一條帶，表明其納米結(jié)構(gòu)粒徑分布相對較窄.如圖2（B）所示，動(dòng)態(tài)光散射（Dynamic light scattering，DLS）測定的 MUC-1/Pt-SNAs 的流體力學(xué)直徑（Ds）約為 148.3 nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.218.MUC-1/Pt-SNAs在透射電子顯微鏡成像下顯示為球形形態(tài)，形貌比較均勻［圖1（C）］，平均粒徑在139.3 nm左右.該結(jié)果說明硫代DNA接枝修飾Pt（Ⅳ）前藥后可以成功自組裝成類似SNA的納米藥物MUC-1/Pt-SNAs.

Fig.2 Characterizations of MUC-1/Pt-SNAs

2.3 MUC-1/Pt-SNAs的穩(wěn)定性及藥物釋放特征

通過DLS表征了MUC-1/Pt-SNAs載藥系統(tǒng)在不同模擬生理pH環(huán)境下的穩(wěn)定性.如圖S7（見本文支持信息）所示，在不同的pH緩沖液中恒溫37 ℃孵育2 h后，MUC-1/Pt-SNAs的粒徑尺寸及分布無明顯變化，從而證明了MUC-1/Pt-SNAs在不同模擬生理pH環(huán)境下具有穩(wěn)定性.

此外，在非還原條件（1×PBS，pH=7.4，37 ℃）和還原條件［含10 mmol/L 谷胱甘肽（GSH）的PBS 溶液，37 ℃］下評估了MUC-1/Pt-SNAs 的藥物釋放行為.如圖2（C）所示，MUC-1/Pt-SNAs 在非還原條件PBS 溶液中比較穩(wěn)定，即使在72 h 后也只釋放出了約11.1%的鉑類藥物.由于還原劑GSH 的存在，Pt（Ⅳ）前藥被還原為二價(jià)順鉑藥物釋放出來.所以，相比之下，MUC-1/Pt-SNAs在含10 mmol/L GSH的還原條件中72 h后釋放了高達(dá)62.2%的鉑類藥物.上述結(jié)果說明MUC-1/Pt-SNAs載藥體系能在正常非還原性環(huán)境中穩(wěn)定存在，降低了順鉑藥物對正常組織的毒副作用；但當(dāng)其到達(dá)富含還原性物質(zhì)的腫瘤組織后，其所接枝負(fù)載的順鉑前藥能夠快速被還原釋放出活性順鉑，抑制腫瘤增殖，提高順鉑藥物生物利用率.

2.4 MUC-1/Pt-SNAs的細(xì)胞攝取行為

為了解決小分子順鉑藥物選擇性低，全身毒副作用大等問題，構(gòu)建了含有主動(dòng)靶向功能MUC-1適配體的MUC-1/Pt-SNAs 球形核酸納米載藥體系.并采用熒光分子Cy5 標(biāo)記的Cy5-MUC-1/Pt-SNAs 評估該納米載藥體系體外腫瘤靶向能力.如圖S8（A）和（B）（見本文支持信息）所示，20%變性PAGE凝膠電泳和1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果證明了Cy5-MUC-1/Pt-SNAs合成組裝成功.

通過流式細(xì)胞儀（FCM）分別測量MUC-1蛋白過表達(dá)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞（MUC-1+）和對照組肝癌HepG 2細(xì)胞（MUC-1-）對Cy5-MUC-1/Pt-SNAs的攝取效率，探究MUC-1/Pt-SNAs納米藥物的細(xì)胞靶向效果.由圖3 可見，分別與Cy5-MUC-1/Pt-SNAs 孵育0.5，1，2，4 和6 h 后，MCF-7 和HepG 2 細(xì)胞內(nèi)的納米藥物熒光信號逐漸增強(qiáng)，表明細(xì)胞對Cy5-MUC-1/Pt-SNAs 納米藥物的攝取量隨時(shí)間的延長而增大.由圖4（A）和（B）可見，在同種細(xì)胞內(nèi)（如MCF-7細(xì)胞），Cy5-MUC-1/Pt-SNAs納米藥物的細(xì)胞攝取量是free Cy5-MUC-1 DNA的10倍左右，差異顯著，表明了Cy5-MUC-1/Pt-SNAs球形核酸納米藥物能有效促進(jìn)細(xì)胞攝取.由圖4（C）可見，與Cy5-MUC-1/Pt-SNAs孵育相同時(shí)間（2 h）后，MCF-7細(xì)胞（MUC-1+）中Cy5-MUC-1/Pt-SNAs 的細(xì)胞攝取量為對照組HepG2 細(xì)胞（MUC-1-）的2.1 倍左右，差異顯著，表明了Cy5-MUC-1/Pt-SNAs具有選擇性靶向MCF-7細(xì)胞（MUC-1+）的能力.

Fig.3 Flow cytometric results of Cy5-MUC-1-Pt-SNAs incubated with MCF-7(A) and HepG 2(B)cells for different time intervals

Fig.4 Cellular uptake behaviors of MUC-1-Pt-SNAs

激光共聚焦顯微鏡成像（CLSM）實(shí)驗(yàn)得到了相同的結(jié)果，其中細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，Cy5標(biāo)記的藥物呈現(xiàn)紅色熒光.如圖5（B）所示，與MUC-1/Pt-SNAs 納米藥物孵育4 h后的MCF-7細(xì)胞中紅色熒光比與free Cy5-MUC-1 DNA 孵育4 h 后更強(qiáng).如圖5（A）和（B）所示，與MUC-1/Pt-SNAs 孵育相同時(shí)間后，MCF-7細(xì)胞（MUC-1+）中顯示出比HepG 2細(xì)胞（MUC-1-）更強(qiáng)的紅色熒光.以上結(jié)果表明所構(gòu)建的Cy5-MUC-1/Pt-SNAs球形核酸納米藥物體系，具有基于球形核酸納米結(jié)構(gòu)和基于MUC-1適配體的主動(dòng)靶向相結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞攝取的效果.

2.5 MUC-1/Pt-SNAs體外腫瘤治療效果

采用細(xì)胞毒性MTT 方法對MUC-1/Pt-SNAs 的體外抗腫瘤效果進(jìn)行評價(jià).MCF-7 和HepG 2 腫瘤細(xì)胞分別與不同濃度的順鉑藥物、Pt（Ⅳ）前藥和MUC-1/Pt-SNAs藥物孵育72 h后，分析細(xì)胞存活率.如圖S9（A）和（B）（見本文支持信息）所示，在MCF-7細(xì)胞中，MUC-1/Pt-SNAs與順鉑藥物的細(xì)胞活性趨勢相似，MUC-1/Pt-SNAs 的IC50值為4.8 μmol/L，低于順鉑藥物的相應(yīng)值；在HepG 2 細(xì)胞中，MUC-1/Pt-SNAs的IC50值為7.8 μmol/L，同樣低于順鉑藥物的相應(yīng)值；且MUC-1/Pt-SNAs在HepG 2（MUC-1-）腫瘤細(xì)胞中的IC50值為在MCF-7（MUC-1+）腫瘤細(xì)胞中的1.6倍.該結(jié)果體現(xiàn)出MUC-1/Pt-SNAs具有比順鉑藥物更好的抑制腫瘤增殖效果，并且具有選擇性抑制MUC-1 蛋白過表達(dá)的MCF-7 腫瘤細(xì)胞增殖的能力.

使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)一步驗(yàn)證了MUC-1/Pt-SNAs誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤生長的效果.如圖6所示，MCF-7細(xì)胞分別與順鉑藥物、Pt（Ⅳ）前藥和MUC-1/Pt-SNAs（鉑藥物濃度均為60 μmol/L）孵育72 h后，其凋亡率分別為78.0%，83.3%和85.4%，其中MUC-1/Pt-SNAs組細(xì)胞凋亡率比順鉑藥物組增加了7.4%.以上結(jié)果證明MUC-1/Pt-SNAs 和順鉑藥物都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且MUC-1/Pt-SNAs具有更好的抑制腫瘤生長效果.

Fig.5 CLSM images of the HepG 2(A)and MCF-7(B)cells after being treated with free Cy5-MUC-1 DNA and Cy5-MUC-1-Pt-SNAs for different time intervals

Fig.6 Cell apoptosis of MCF-7 cells after being treated with different drug formulations(60 μmol/L Pt,72 h)

2.6 MUC-1/Pt-SNAs的體內(nèi)抗腫瘤效果

為了系統(tǒng)評估MUC-1/Pt-SNAs的體內(nèi)抗腫瘤效果，建立了MCF-7細(xì)胞荷瘤裸鼠動(dòng)物模型，并分別給予PBS（作為對照）、順鉑藥物和MUC-1/Pt-SNAs藥物治療（順鉑含量均為4 mg/kg）.如圖7（A）和（B）所示，各治療組MCF-7 腫瘤的起始尺寸相當(dāng)，給藥第15 d 時(shí)，MUC-1/Pt-SNAs 治療組的腫瘤體積小于PBS 對照組的腫瘤體積，差異顯著；且MUC-1/Pt-SNAs 治療組的腫瘤體積比順鉑藥物治療組更小.以上結(jié)果說明MUC-1/Pt-SNAs能夠有效抑制腫瘤增殖，甚至抑制效果比順鉑更好.而順鉑藥物在治療后期毒副作用明顯，如圖7（C）和圖S10（見本文支持信息）所示，順鉑藥物治療組裸鼠體重急劇下降，形體消瘦不健康；而對照組和MUC-1/Pt-SNAs 治療組在治療期間，體重和生存狀態(tài)正常，并未發(fā)生明顯變化.以上結(jié)果表明與游離順鉑藥物相比，MUC-1/Pt-SNAs 因其具有靶向腫瘤細(xì)胞能力，能夠更出色地抑制腫瘤增殖，與此同時(shí)大大降低了順鉑藥物的毒副作用.

Fig.7 In vivo therapeutic efficacy of MUC-1-Pt-SNAs in the athymic nude mice bearing human breast cancer MCF-7 cells

此外，通過組織病理學(xué)和免疫熒光分析考察藥物對小鼠器官和皮下腫瘤的細(xì)胞形態(tài)以及對腫瘤凋亡的影響.其中，用組織病理學(xué)表征治療后各組器官和腫瘤細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果如圖S11（見本文支持信息）所示，MUC-1/Pt-SNAs治療組中心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟組織的細(xì)胞形態(tài)均沒有明顯損傷，證明了MUC-1/Pt-SNAs具有良好的安全性及低毒副作用.如圖7（D）所示，MUC-1/Pt-SNAs和順鉑藥物治療組的腫瘤細(xì)胞中均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核皺縮和空泡化現(xiàn)象，且MUC-1/Pt-SNAs治療組細(xì)胞核皺縮數(shù)目比順鉑藥物治療組更多，而對照組的細(xì)胞核形態(tài)正常.原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）法可以標(biāo)記凋亡細(xì)胞發(fā)出綠色熒光.由圖7（D）可見，MUC-1/Pt-SNAs治療組的腫瘤細(xì)胞核里呈現(xiàn)大量綠色熒光，而順鉑藥物治療組和對照組則較少.以上結(jié)果說明MUC-1/Pt-SNAs能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，甚至比順鉑藥物治療效果更好，且對其它器官具有極低的毒副作用，這與前面體內(nèi)治療MCF-7細(xì)胞荷瘤裸鼠的腫瘤體積及體重變化結(jié)果一致.

3 結(jié) 論

構(gòu)建了通過硫代磷酸酯修飾的嵌段DNA接枝Pt（Ⅳ）前藥形成核酸-順鉑前藥綴合物，進(jìn)而自組裝成類似球形核酸的新型鉑類納米藥物遞送系統(tǒng)MUC-1/Pt-SNAs.該球形核酸納米藥物MUC-1/Pt-SNAs生物相容性好，合成簡單，載藥率高達(dá)39.6%，具有較為均一的粒徑，在模擬生理環(huán)境下具有較好的穩(wěn)定性.MUC-1/Pt-SNAs 還具有還原響應(yīng)性釋放藥物的特點(diǎn)，核酸適配體的引入賦予其優(yōu)異的靶向性，使其能夠高效靶向進(jìn)入MUC-1 蛋白高表達(dá)的MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞，減少了對正常組織細(xì)胞的毒副作用.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示MUC-1/Pt-SNAs具有良好的抗腫瘤治療效果，并且大大降低了順鉑藥物的毒副作用.因此，該MUC-1/Pt-SNAs納米藥物遞送系統(tǒng)在高效腫瘤靶向治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200283.