劉 哲,譚 穎,趙 偉,馬銘宇,王夢欣,張全勝

(煙臺大學(xué)海洋學(xué)院,山東 煙臺 264005)

自然條件下,植物暴露于光強不斷變化的環(huán)境中．低光時,植物的光系統(tǒng)高效運轉(zhuǎn)捕光天線提高光利用效率,以實現(xiàn)最優(yōu)光合作用．過量光時,為避免活性氧光氧化破壞光合機構(gòu),植物進(jìn)化出多種防御機制[1-2],如將過剩激發(fā)能以熱能形式進(jìn)行耗散,即非光化學(xué)淬滅(non-photochemical quenching, NPQ)[3]．不同植物NPQ能力差異是遺傳因素與光強、溫度、營養(yǎng)及水分等環(huán)境因子共同作用所致[4],同一種植物的葉片年齡等生理狀態(tài)也決定了NPQ光保護(hù)能力的大小[5],上述因素同時還影響了NPQ各組分對總NPQ能力的貢獻(xiàn)[6]．

已有研究表明,至少有3種機制在NPQ中發(fā)揮作用:依賴能量或pH耗散、狀態(tài)轉(zhuǎn)換及光抑制[6-8]．這3種組分最初根據(jù)大麥葉綠素?zé)晒獯銣珩Y豫動力學(xué)分析得到,將快相(t1/2=1～2 min)、中間相(t1/2=5～10 min)和慢相(t1/2> 60 min)分別定義為依賴能量淬滅(qE)、狀態(tài)轉(zhuǎn)換淬滅(qT)和光抑制淬滅(qI)[9]．qE是多數(shù)藻類和高等植物NPQ的主要組分[10],能有效降低飽和光下光合電子傳遞鏈電子壓力[11]．跨膜質(zhì)子梯度(ΔpH)、葉黃素循環(huán)、PsbS蛋白和捕光色素復(fù)合體(Light-harvesting complex II, LHCII)是qE形成過程的必要因素[12]．qT是由狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程引發(fā)的熒光淬滅,主要受到質(zhì)體醌庫氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)[13]．狀態(tài)轉(zhuǎn)換通常在低光下發(fā)生,而WALTERS等[14]發(fā)現(xiàn)高光脅迫下大麥具有較大波幅的中間相．據(jù)此,NILKENS等[15]通過比較高光下野生型(wild type, WT)擬南芥NPQ和玉米黃素(Zeaxanthin, Zx)轉(zhuǎn)化的動力學(xué),發(fā)現(xiàn)此條件下的中間相不再與狀態(tài)轉(zhuǎn)化有關(guān),而是與Zx的形成及轉(zhuǎn)化有關(guān),因此命名為依賴玉米黃素淬滅組分(qZ)．qI包括導(dǎo)致PSII長時間下調(diào)、失活或損傷等過程產(chǎn)生的所有熒光淬滅,主要在高光長時間脅迫過程中被激活[7]．PSII持續(xù)下調(diào)或不可逆失活均伴隨著Zx的滯留,意味著Zx在qI中扮演重要角色[16]．

從PSII到PSI的電子流動,導(dǎo)致質(zhì)子(H+)從類囊體基質(zhì)側(cè)泵入腔內(nèi)形成跨膜質(zhì)子動勢(proton motive force,pmf)[17]．ΔpH作為pmf組分,是NPQ關(guān)鍵調(diào)控信號．據(jù)KRESS等[18]報道,擬南芥pgr1(ΔpH構(gòu)建缺陷) NPQ較WT低,這表明ΔpH構(gòu)建在NPQ中發(fā)揮重要作用．其一,ΔpH的構(gòu)建使游離紫黃素脫環(huán)氧化酶(Violaxanthin De-epoxidase, VDE)結(jié)合到類囊體膜上,催化紫黃素(Violaxanthin, Vx)脫環(huán)氧化為Zx[19]．Zx可作為PSII膜變構(gòu)調(diào)節(jié)劑增強LHCII與質(zhì)子結(jié)合親和力,從而誘導(dǎo)NPQ的發(fā)生[6]．其二,ΔpH的構(gòu)建使PsbS蛋白發(fā)生質(zhì)子化,改變PSII天線構(gòu)象,加速NPQ誘導(dǎo)過程[20]．目前對pmf研究多集中于成熟葉,而對其他葉齡研究相對較少[21-23]．

常春藤(Hederanepalensis)是五加科(Araliaceae)的一類常綠攀援灌木,分布范圍廣[28],被廣泛用于園林綠化．常春藤為陰生植物,相比陽生植物,對其光合特性的關(guān)注較少,光保護(hù)性能的認(rèn)識有限．本文通過分析常春藤3種葉齡葉片的NPQ誘導(dǎo)和馳豫特征、組分、光保護(hù)效率及ΔpH,以明確常春藤非光化學(xué)淬滅特性．

1 材料與方法

1.1 常春藤采集

選擇生長天數(shù)分別為15、30和90 d的幼葉(Young Leaf, YL)、成熟葉(Mature Leaf, ML)和老葉(Old Leaf, OL)為實驗材料．煙臺大學(xué)植物園內(nèi)同一位置,采集健康且大小均一的葉片,每種葉齡3個重復(fù)．實驗室內(nèi)用清水沖洗葉片表面灰塵,于溫度為25 ℃培養(yǎng)箱中暗適應(yīng),次日實驗．

1.2 熒光測量

使用便攜式脈沖調(diào)制熒光儀(MINI-PAM, Walz, Effeltrich, Germany)測量常春藤的葉綠素?zé)晒猓鶕?jù)快速光響應(yīng)曲線擬合得到的最小飽和光強(Ek),設(shè)置低光(0.5 Ek)、中光(Ek)和高光(6 Ek)．經(jīng)暗適應(yīng)12 h葉片暴露于光下40 min,隨后立即暗恢復(fù)40 min．葉片置于濕潤平皿中進(jìn)行整個測量過程,以保持葉片活性．通過施加飽和脈沖(saturating white light pulse, SP)測量NPQ誘導(dǎo)和馳豫過程．NPQ計算公式為(Fm-Fm′)/Fm′,Fm為暗適應(yīng)后最大熒光,Fm′為光下最大熒光．NPQ誘導(dǎo)過程中NPQ最大值(the maximum for NPQ, NPQmax)、NPQ誘導(dǎo)速率(NPQ induction rate,kNPQ)和達(dá)到NPQmax所需時間,擬合自指數(shù)函數(shù)NPQ(time)=NPQmax×[1-exp(-kNPQ·t)]．根據(jù)GUADAGNO等[29]建立的方法計算Y(NPQ)、Y(NO)、Y(II)及NPQ各組分的量子產(chǎn)量．

參照RUBAN和MURCHIE[6]的方法,使用雙通道熒光儀(DUAL-PAM-100, Walz, Effeltrich, Germany)記錄葉綠素?zé)晒獾淖兓^程．提供8種強度的光化光(1/4 Ek、1/2 Ek、Ek、2 Ek、3 Ek、4 Ek、5 Ek和6 Ek),分別測得每個光強下的NPQ、qPd和Y(II)．

1.3 跨膜質(zhì)子梯度測量

使用DUAL-PAM-100的P515/535模塊測量雙波長550～515 nm差示吸收(反映Electrochromic pigment shift, ECS)．測量前,所有暗適應(yīng)12 h葉片分別暴露于低光(0.5 Ek)和高光(6 Ek)下,隨后立即暗適應(yīng)15 min．通過暗-光-暗測量過程,記錄ECS的變化．根據(jù)CRUZ等[30]的方法,確定pmf及ΔpH大小．

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件,分析數(shù)據(jù)前進(jìn)行方差齊性檢驗．以葉齡作為自變量,NPQ誘導(dǎo)速率(kNPQ)、PSII調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y(NPQ)]等為因變量進(jìn)行單因素方差分析．Tukey’s檢驗進(jìn)行多重比較,以P<0.05作為差異顯著性水平．利用Origin 9.0對NPQ進(jìn)行非線性擬合．

2 結(jié)果與分析

2.1 NPQ誘導(dǎo)特征

低光及中光下,3幼葉(YL)、成熟葉(ML)和老葉(OL)的NPQ在光照初期達(dá)到最大值,隨后快速下降至穩(wěn)定值(圖1(a)及(b))．3種葉齡NPQ在高光脅迫初期均可誘導(dǎo)至最大值,隨后在剩余脅迫時間內(nèi)保持穩(wěn)定(圖1(c))．隨著光強增加,kNPQ逐漸降低,伴隨著NPQmax及達(dá)到NPQmax所需時間增加(表1)．所有光脅迫下,3種葉齡NPQ具有相似誘導(dǎo)速率,即達(dá)到NPQmax所需時間無顯著差異(低光Tukey’s test,P=0.999,P=0.935,P=0.947; 中光Tukey’s test,P=0.876,P=0.985,P=0.942; 高光Tukey’s test,P=0.962,P=0.672,P=0.819)．然而,3種葉齡最大NPQ能力不同．老葉NPQmax分別為0.38、1.46和2.66．成熟葉NPQmax顯著增加(Tukey’s test,P<0.05,P<0.05,P<0.05),分別為1.37、1.60和3.05．幼葉NPQmax最小,分別為0.21、0.74和2.07．

表1 3種葉齡NPQ誘導(dǎo)特征參數(shù)比較

2.2 NPQ馳豫特征

暗恢復(fù)40 min內(nèi),3種葉齡經(jīng)低光和中光處理均可發(fā)生完全馳豫(圖2(a),(b)),而高光處理的并未發(fā)生完全馳豫(圖2(c))．高光脅迫成熟葉和老葉均在暗處理5 min內(nèi)馳豫至穩(wěn)定水平,而幼葉馳豫至穩(wěn)定水平的時間約為15 min．

2.3 NPQ組分

根據(jù)3種葉齡NPQ馳豫動力學(xué),分析得參與淬滅過程的有3種組分(qE、qT和qI) (圖3)．低光下,狀態(tài)轉(zhuǎn)換淬滅的量子產(chǎn)量[Y(qT)]是PSII調(diào)節(jié)性非光化學(xué)淬滅的量子產(chǎn)量[Y(NPQ)]主要組成部分,光抑制淬滅的量子產(chǎn)量[Y(qI)]接近于0．光強高于0.5 Ek時,依賴能量淬滅的量子產(chǎn)量[Y(qE)]顯著增加成為NPQ主要組分,伴隨著Y(qI)增加,而Y(qT)無顯著變化．相比較而言,成熟葉Y(qE)增幅最大,老葉次之,幼葉最小,而Y(qI)增幅則相反．成熟葉NPQ光保護(hù)組分(qE和qT)消耗能量顯著高于老葉和幼葉,Y(qI)顯著低于老葉和幼葉．

2.4 NPQ光保護(hù)效率

從低光到高光,3種葉齡PSII光化學(xué)消耗及非調(diào)節(jié)性非光化學(xué)淬滅的量子產(chǎn)量[Y(II)和Y(NO)]均呈下降趨勢,Y(NPQ)呈增加趨勢(圖4(a))．成熟葉、老葉和幼葉Y(NPQ)呈遞減趨勢,而Y(NO)無顯著差異(低光Tukey’s test,P=0.910,

P=0.497,P=0310;中光Tukey’s test,P=0.262,P=0.980,P=0.207;高光Tukey’s test,P=0.471,P=0.819,P=0.808)．Y(NPQ)/Y(NO)表示通過能量耗散實現(xiàn)光保護(hù)的能力,隨光強增強而逐漸增強(圖4(b))．老葉Y(NPQ)/Y(NO)分別為0.22、0.26和2.61．成熟葉顯著增加,分別為0.25、0.35和2.96 (Tukey’s test,P< 0.05,P< 0.05,P< 0.05)．幼葉通過能量耗散實現(xiàn)光保護(hù)能力最弱,分別為0.17、0.21和2.45．

2.5 跨膜質(zhì)子梯度的構(gòu)建

低光和高光脅迫下,3種葉齡跨膜質(zhì)子動勢(pmf)及跨膜質(zhì)子梯度(ΔpH)具有相似變化趨勢(圖7)．光照初期達(dá)到最大值,隨后發(fā)生下降,并在剩余光照時間內(nèi)保持穩(wěn)定．相對于低光脅迫,高光脅迫下ΔpH和pmf均處較高水平． 所有處理下, 成熟葉pmf及ΔpH最大值均高于老葉和幼葉,且在光照40 s內(nèi)即可達(dá)到最大值．其中,老葉和幼葉在光照1 min內(nèi)達(dá)到ΔpH最大值,前者最大值分別為1.98和3.40,而后者分別為0.93和2.87．

3 討 論

NPQ可表示PSII過剩激發(fā)能的熱耗散能力[25],增加的NPQ與PSII受到的光保護(hù)程度呈線性相關(guān),即NPQ能力意味著PSII受到光保護(hù)的程度[7, 31]．3種葉齡NPQ均可在光照幾分鐘內(nèi)達(dá)到最大值,且NPQmax隨光強增強而增加．同時,成熟葉NPQmax顯著高于老葉和幼葉．有研究表明,NPQ能力強的植物經(jīng)過光脅迫后,可快速馳豫[7]．ML和OL經(jīng)高光脅迫后NPQ均可快速馳豫,而幼葉馳豫緩慢．因此,隨光強增強,三種葉齡NPQ能力增強,其中成熟葉具最高NPQ能力．

低光下主要組分是qT,而qI幾乎不存在,表明此時尚未發(fā)生光抑制,主要通過狀態(tài)轉(zhuǎn)化以維持最大光化學(xué)效率[32]．從低光到高光,Y(qE)和Y(qI)逐漸增加．其中,成熟葉、老葉和幼葉Y(qE)增幅呈遞減趨勢,而Y(qI)呈遞增趨勢．結(jié)果表明,盡管常春藤受到光抑制程度逐漸加重,但依賴能量耗散途徑仍處于高效運轉(zhuǎn)狀態(tài)以發(fā)揮光保護(hù)作用．

光強增強過程中,3種葉齡Y(NPQ)的增加表明光保護(hù)能力增強,可以補充降低的Y(II),甚至導(dǎo)致Y(NO)降低．成熟葉光保護(hù)指標(biāo)[Y(NPQ)][33]高于其他2種葉齡,尤其是幼葉,意味著成熟葉將過剩激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱能相對高效．幼葉光損傷指標(biāo)[Y(NO)]最高,反映調(diào)節(jié)性能量耗散能力不足以維持大量PSII反應(yīng)中心處于開放狀態(tài),導(dǎo)致光抑制程度加重．飽和光下,植物表現(xiàn)出較低Y(NO)和較高Y(NPQ)或Y(NPQ)/Y(NO),意味著已達(dá)到最佳光保護(hù)能力[34]．因此,隨光強增強,常春藤光保護(hù)能力增強,其中成熟葉光保護(hù)能力最強．

采用RUBAN和MURCHIE[6]的新方法,檢測波動光下光合作用的動態(tài)變化,以明確常春藤NPQ保護(hù)效率．整個測量過程中,3種葉齡NPQ隨光強增強而逐漸增加,表明三者NPQ形成無顯著差異．相對于老葉和幼葉,成熟葉開始發(fā)生光抑制時NPQ處于較高水平,且能承受更高的光強,意味著成熟葉形成的NPQ足以抵消光強增強產(chǎn)生的有害影響,從而具有較高的光耐受能力．老葉和幼葉光抑制起點相同,但前者qPd高于后者,表明老葉NPQ保護(hù)效率高于幼葉．

常春藤NPQ和ΔpH于低光下具有相似趨勢,高光下卻有差異．光脅迫初期,硫氧還蛋白尚未激活卡爾文循環(huán)和ATP合成[35-36]．此時,常春藤構(gòu)建的ΔpH全部用以激活NPQ．然而,低光誘導(dǎo)流入腔內(nèi)的質(zhì)子是有限的．當(dāng)ATP合成啟動后,導(dǎo)致部分質(zhì)子從腔內(nèi)泵至基質(zhì)內(nèi),使得腔內(nèi)pH升高,阻礙了VDE完全激活,無法維持穩(wěn)定NPQ[36]．因此,常春藤NPQ在低光下瞬時產(chǎn)生．相對于低光,高光脅迫下葉片構(gòu)建的ΔpH可維持VDE處于完全激活狀態(tài),足以支撐NPQ處于最高水平．相對于老葉和幼葉,成熟葉構(gòu)建ΔpH水平最高,且達(dá)到ΔpH最大值所需時間最短．老葉和幼葉達(dá)到ΔpH最大值所需時間相似,但前者最大值高于后者．因此,常春藤于高光脅迫下構(gòu)建ΔpH能力強于低光脅迫,成熟葉、老葉和幼葉構(gòu)建ΔpH能力呈降低趨勢．

CARVALHO等[27]測得野生型擬南芥于4 Ek時開始發(fā)生光抑制,pNPQ為2.5．常春藤屬于陰生植物,3 Ek時開始發(fā)生光抑制,pNPQ為2.2．此外,陽生植物NPQmax為4.0～5.0[37],而常春藤NPQmax為3.0．因此,常春藤光耐受能力及光保護(hù)效率均低于陽生植物．