水產(chǎn)用蛭弧菌近幾年又火了起來(lái)，因?yàn)榛瘜W(xué)消毒劑在控菌方面雖然效果來(lái)得快，但在控菌時(shí)間上面存在著嚴(yán)重的缺陷，用后12～24h左右，總菌數(shù)就有可能反彈超標(biāo)，而水產(chǎn)用蛭弧菌在這方面恰恰存在著一定的優(yōu)勢(shì)，但是作為一個(gè)生物制劑，其不確定性也存在很多方面，為此作者將用11個(gè)小問(wèn)題來(lái)圍繞蛭弧菌做一些講解，希望能讓大家更好的了解蛭弧菌產(chǎn)品。

1 蛭弧菌是什么？

在水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)上，只要你不徹底排斥消毒，那么蛭弧菌就是繞不開(kāi)的一個(gè)產(chǎn)品。

首先要了解什么呢？最簡(jiǎn)單的，我們要知道蛭弧菌到底是什么？——蛭弧菌是一種生物消毒劑！

人類(lèi)目前擁有三種消毒方法：物理消毒法、化學(xué)消毒法、生物消毒法。

其中生物消毒法會(huì)用到生物消毒劑，它包括：植物提取物、細(xì)菌、噬菌體、生物酶、抗菌肽，這其中的的細(xì)菌一般就是指蛭弧菌。

蛭弧菌實(shí)際是在1962年由Stolp和Petzold首次發(fā)現(xiàn)于菜豆葉燒病假單胞菌體中，隨后從土壤、污水中都分離到了這種細(xì)菌。所以蛭弧菌從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在才不過(guò)50多年的時(shí)間。

蛭弧菌命名為Bdellovibriobacteriovorus。其中，Bdello一詞來(lái)自希臘字，是“水蛭”的意思，“vibrio”意為“弧菌”，而種名“bacteriovorus”是“食細(xì)菌”的意思。其命名很有意思，“水蛭”代表了其生理上的一些動(dòng)作形為，蛭弧菌的捕食生活方式很特殊，它是寄生于其他細(xì)菌并能導(dǎo)致其裂解的一類(lèi)細(xì)菌。請(qǐng)注意，蛭弧菌不是從外到內(nèi)吃掉其他細(xì)菌，而是鉆到其他細(xì)菌體內(nèi)，從內(nèi)到外裂解其它細(xì)菌。

另外有，有些人一直分不太清楚噬菌蛭弧菌和噬菌體，實(shí)際很簡(jiǎn)單，前者是吃細(xì)菌的細(xì)菌，后者是吃細(xì)菌的病毒。

2 蛭弧菌到底長(zhǎng)什么樣子

首先蛭弧菌很小，0.3～0.6×0.8～1.2um，1mm的長(zhǎng)度可以并排放2,500個(gè)左右，長(zhǎng)度大概為桿菌的三分之一至五分之一，顯微鏡中至少要用到油鏡才能看得到它，而且要在染色的情況下。因此被稱(chēng)為“世界上最小的捕食者”之一。

想像一下小蝌蚪，蛭弧菌差不多就是這個(gè)外形。它的腦袋呈弧形或者桿狀，有時(shí)候也呈螺旋形，外加一個(gè)長(zhǎng)尾巴鞭毛，與鞭毛相對(duì)的一端有釘狀纖毛，被稱(chēng)為“感染錐子”。它的鞭毛很牛，明明個(gè)子比細(xì)菌要小不少，但鞭毛卻比一般細(xì)菌的粗3～4倍。

3 蛭弧菌有什么獨(dú)門(mén)絕技？

蛭弧菌有兩個(gè)獨(dú)門(mén)絕技可以打破敵人的防御，一是鐵頭功，二是無(wú)敵風(fēng)火輪。

蛭弧菌入侵細(xì)菌的方式非常獨(dú)特，首先，它到處游動(dòng)，實(shí)際上一般10min左右它就會(huì)找到可以寄生的細(xì)菌，也就是宿主菌。然后它就用鐵頭功，猛烈碰撞宿主細(xì)胞，速度每秒高達(dá)100個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度，如果是人的話，速度就是每秒一百七八十米，瘋狂的撞擊，無(wú)鞭毛的那一端附著于宿主細(xì)胞壁上，不過(guò)100次的碰撞大概只會(huì)有3次成功，相當(dāng)不容易。

吸附成功后，蛭弧菌采用無(wú)敵風(fēng)火輪，開(kāi)始瘋狂旋轉(zhuǎn)，每秒幾乎能達(dá)到100轉(zhuǎn)，從鉆孔到進(jìn)入只需幾秒種。不過(guò)進(jìn)入宿主細(xì)胞之后，鞭毛就會(huì)不要了。

4 蛭弧菌的繁殖速度快么？

為什么使用蛭弧菌48小時(shí)后才能做平板檢測(cè)？為什么蛭弧菌的見(jiàn)效時(shí)間這么長(zhǎng)？

這主要是和蛭弧菌的繁殖速度有關(guān)系。實(shí)際上蛭弧菌生長(zhǎng)速度是很慢的：

4.1 繁殖代時(shí)長(zhǎng)

蛭弧菌繁殖一代的時(shí)間需要大概4h左右，在試驗(yàn)室狀態(tài)下，大腸桿菌17min一代，枯草芽孢桿菌30min一代，這之間的差距是非常大的。

4.2 蛭弧菌不是指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)

蛭弧菌是自我復(fù)制式的生殖，一次可以產(chǎn)生6～36個(gè)后代。8h的極限數(shù)值才不過(guò)36×36=1,296個(gè)，如果是枯草芽孢在極限狀態(tài)下，8h可產(chǎn)生65,536個(gè)后代，相差近51倍。

這就是蛭弧菌一個(gè)很大的問(wèn)題，所以在實(shí)際使用的時(shí)候，建議加大劑量，或者連續(xù)多天使用。

5 蛭弧菌殺菌有選擇性么？

蛭弧菌能區(qū)分善惡么？——可能么？即便是不做研究，我個(gè)人都認(rèn)為不可能，自然界中會(huì)存在這樣一種微生物？它知道我們水產(chǎn)養(yǎng)殖的有益菌有哪些而不進(jìn)攻它們？

蛭弧菌與宿主細(xì)胞之間，常表現(xiàn)出一定的特異性。不過(guò)，有的特異性較差，能侵入多種細(xì)菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各類(lèi)不同的植物病原菌。

從這一點(diǎn)上看，其比噬菌體（病毒）、細(xì)菌素（蛋白質(zhì)）的廣譜性要好。實(shí)際上蛭弧菌可感染許多不同科屬的菌，但其總體上有一定偏向性，比如其可感染大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌（如志賀氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、變形桿菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、鉤端螺旋體等微生物），但只對(duì)少數(shù)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感興趣，同時(shí)也有報(bào)道指出其對(duì)某些真菌和腸道病毒也有一定的裂解活性。

圖1 （出自：孫秋平.蛭弧菌的分離純化及保質(zhì)期的研究[D].華南理工大學(xué),2014.）

圖2 48,000倍下的蛭弧菌[出自：宋志萍、蔡俊鵬、王志、韓韞，蛭弧菌的分離及其生長(zhǎng)條件和裂解能力的研究，微生物學(xué)報(bào)，2005，45（4）：573.]

圖3 氦離子顯微鏡下的蛭弧菌（像素大小0.75納米）[出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

——寄生的特異性也對(duì)我們的實(shí)際使用方法有很大的影響，即蛭弧菌是不是不管好菌壞菌都會(huì)攻擊？如果是這樣的話，那么很難被我們所用了，但實(shí)際上，其有一定傾向性，這就給我們實(shí)際的應(yīng)用提供了更多的可能性。

郭衍彪（2016年）的研究指出，蛭弧菌BDW03對(duì)試驗(yàn)組大菱鲆腸道沒(méi)有控制作用的菌屬為8個(gè)（占53.3%），這8個(gè)菌屬中多為革蘭氏陽(yáng)性菌屬（6/8）。另外，其通過(guò)乳酸菌拌食餌料和潑灑BALOs喂食大菱鲆60d后，乳酸菌和BALOs對(duì)大菱鲆腸道菌群中革蘭氏陰性菌的控制作用（分別占總菌屬的33.3%和26.7%）優(yōu)于對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的控制作用（分別占總菌屬的（26.7%和20.0%）。這也間接指出了蛭弧菌對(duì)細(xì)菌的裂解可能有一定的偏向性。

另外，結(jié)合陳家長(zhǎng)等人（2003）、徐琴等人（2006）、陳麗蕓（2012）的研究，我們至少可以獲得以下結(jié)論。

第一、不同類(lèi)型的蛭弧菌能裂解的宿主菌是有差異的；

第二、蛭弧菌可以和光合細(xì)菌中的球形紅假單胞菌混合使用，也可以間隔7d使用，外潑效果都非常好。蛭弧菌和粘紅酵母混合使用，外沷效果不佳；同時(shí)外用蛭弧菌的效果控制時(shí)間至少可以達(dá)到2周，即14d的時(shí)間。而且這還是受限于方案的要求。

第三、蛭弧菌不裂解乳酸桿菌。

第四、在斑節(jié)對(duì)蝦的試驗(yàn)研究中，蛭弧菌和枯草芽孢桿菌混合外沷使用沒(méi)有單獨(dú)使用蛭弧菌效果好。但混合使用比不使用的對(duì)照組在控制總菌上效果要好。

第五、對(duì)大菱鲆的內(nèi)服研究表明，蛭弧菌對(duì)腸道內(nèi)芽孢桿菌屬的增殖影響比較小。

6 蛭弧菌和化學(xué)消毒劑的差別在哪里？

化學(xué)消毒劑包括抗生素的殺菌都有一個(gè)特征，來(lái)得快去得快，在達(dá)到一定濃度下，化學(xué)消毒劑的效力可能會(huì)在4個(gè)小時(shí)左右達(dá)到最高峰，細(xì)菌總數(shù)下降到最低，然后細(xì)菌總數(shù)會(huì)出現(xiàn)反彈，但消毒劑仍有效果，總菌數(shù)有可能在12～24h左右反彈超標(biāo)，超過(guò)原來(lái)的細(xì)菌總數(shù)，當(dāng)然，細(xì)菌的種類(lèi)發(fā)生了變化。

而蛭弧菌可能在前1～2d內(nèi)看不出來(lái)什么效果，但如果其能發(fā)揮效果，那么控菌的時(shí)長(zhǎng)有可能達(dá)到15d以上，甚至20d以上，在此期間，總菌數(shù)、弧菌數(shù)相對(duì)于對(duì)照組可能會(huì)低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。

比如張呂平等人（2009）的研究指出，對(duì)蝦池水體分別潑灑二氯異氰脲酸、季胺鹽絡(luò)合碘和蛭弧菌。當(dāng)每隔20d左右分別進(jìn)行一次上述水體處理,通過(guò)比較體內(nèi)弧菌感染的對(duì)蝦個(gè)體數(shù),發(fā)現(xiàn)從肝胰腺分離到弧菌的對(duì)蝦數(shù)量二者無(wú)顯著差異,但從血淋巴分離到弧菌的對(duì)蝦數(shù)量,蛭弧菌處理組顯著少于化學(xué)消毒劑處理組。

能長(zhǎng)期控菌，這是蛭弧菌的優(yōu)勢(shì)所在，也是與化學(xué)消毒劑最大的差異所在。

7 蛭弧菌耗氧么？可以擴(kuò)培么？

蛭弧菌是嚴(yán)格的好氧菌，它的繁殖需要氧氣，但它對(duì)池塘的溶氧幾乎又沒(méi)有什么干擾，為什么？因?yàn)樗姆敝乘俣忍恕?/p>

有多慢，請(qǐng)參看上第四問(wèn)。

另外，我們都知道，可以用紅糖等碳源對(duì)乳酸菌及EM菌進(jìn)行擴(kuò)培，那蛭弧菌可以用這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)培么？很明確，不可以。

因?yàn)轵位【焕锰妓衔?，所以無(wú)法用碳源進(jìn)行擴(kuò)培。

實(shí)際上從自然界分離得到的蛭弧菌都是依賴(lài)寄生型，迄今為止，還沒(méi)有直接從自然界分離得到非寄生型。不依賴(lài)宿主的蛭弧菌，只能生活在實(shí)驗(yàn)室條件下。

8 蛭弧菌有哪些產(chǎn)品可以選擇？

市面上的蛭弧菌有三種：液體的、粉末狀的、凍干粉。

圖4 氦離子顯微鏡下的大腸桿菌（左）和葡萄球菌（右）細(xì)胞被蛭弧菌感染的圖片。像素尺寸為1nm。[出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

圖5 蛭弧菌的繁殖周期示意圖[出自：Makowski L ,Trojanowski D ,Till R ,et al.Dynamics of chromosome replication and its relationship to predatory attack lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus[J].Applied and Environmental Microbiology,2019,85(14):-.]

液體使用方便，但菌數(shù)容易掉。而且蛭弧菌液體的產(chǎn)品始終面臨保存的問(wèn)題，實(shí)際上也有很多的論文對(duì)此做了研究，有的文章指出，大多數(shù)的液體蛭弧菌產(chǎn)品在4℃的環(huán)境下，可以保存8個(gè)月以上，少數(shù)6個(gè)月以上。但在25℃的環(huán)境下，蛭弧菌液體產(chǎn)品的保質(zhì)一般只在4～6個(gè)月了。當(dāng)然隨著保護(hù)劑的不斷研發(fā)，隨著添加不同的保護(hù)劑，在4℃的環(huán)境下，某些液體產(chǎn)品的保質(zhì)期可以達(dá)到15個(gè)月以上，有的可以達(dá)到兩年以上，但是所有的保存環(huán)境溫度都指向4℃，這對(duì)我們實(shí)際的銷(xiāo)售場(chǎng)景是不太相符的。當(dāng)然，液體也有好處，菌種復(fù)蘇時(shí)間快，如果從實(shí)際銷(xiāo)售出發(fā)，建議在經(jīng)銷(xiāo)點(diǎn)增設(shè)冷藏柜，這樣可以延長(zhǎng)液體產(chǎn)品的保持期。

粉末狀有些說(shuō)是托盤(pán)凍干的，有裝到鋁箔袋中的，也有裝到西林瓶中的。

原裝凍干粉則是近幾年推出的產(chǎn)品，菌種的穩(wěn)定性是無(wú)與倫比的，只能裝到西林瓶中，而且每一瓶都必需是真空包裝的。在相關(guān)的研究中，4℃的環(huán)境下，添加了保護(hù)劑的蛭弧菌液體產(chǎn)品在13個(gè)月后其復(fù)蘇率為100%，而同樣的環(huán)境下，凍干產(chǎn)品在21個(gè)月后其復(fù)蘇率仍為100%。

而且真正的蛭弧菌原裝凍干產(chǎn)品，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

冷凍干燥生產(chǎn)工藝是在低溫下進(jìn)行的，對(duì)于許多熱敏性的物質(zhì)特別適用。蛭弧菌不會(huì)發(fā)生變性或失去生物活力，這一點(diǎn)非常重要。

整個(gè)冷凍生產(chǎn)過(guò)程基本上是在低溫真空狀態(tài)下完成的，在這種狀態(tài)下，微生物的生長(zhǎng)和酶作用是受到抑制的，可以很好的保證蛭弧菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

因在真空下操作，氧氣極少，因此，一些易氧化的物質(zhì)（如油脂類(lèi)）得到保護(hù)。

冷凍干燥法能排除95%～99%以上的水分，產(chǎn)品能長(zhǎng)期保存而不變質(zhì)。

以上就是蛭弧菌凍干產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)所在，也是其穩(wěn)定性的保障所在。

9 蛭弧菌的凍干粉是如何生產(chǎn)的？

蛭弧菌凍干粉的生產(chǎn)需要兩組機(jī)器，一是發(fā)酵罐，二是凍干機(jī)，前者幾十萬(wàn)，后者近百萬(wàn)，硬件投資算是一個(gè)門(mén)檻。

9.1 發(fā)酵

蛭弧菌的發(fā)酵和其他產(chǎn)品就差別很大，蛭弧菌的發(fā)酵前后需要一周的時(shí)間，在微生物的發(fā)酵時(shí)間上，算是最長(zhǎng)的一類(lèi)了，生產(chǎn)起來(lái)較為麻煩。

9.2 凍干

凍干則更是一個(gè)精細(xì)的活了。

其基本流程包括：灌裝、裝蓋、擺盤(pán)、凍干、壓蓋。當(dāng)然可能使用一些自動(dòng)設(shè)備，在具體的步驟上會(huì)略有差別。但總體步驟變化不大。

半成品進(jìn)入凍干機(jī)后，通過(guò)凍結(jié)、升華、再干燥三個(gè)過(guò)程，通過(guò)升華過(guò)程將母液中的冰幾乎全部散發(fā)掉后，再由機(jī)器統(tǒng)一壓蓋，保證每一瓶產(chǎn)品內(nèi)均處于“真空”狀態(tài)。

10 蛭弧菌原裝凍干粉有什么特點(diǎn)？

蛭弧菌原裝凍干粉的概念是我在2018年底提出，特指蛭弧菌母液和西林瓶一起在凍干機(jī)中完成凍干，每一瓶成品均為真空狀態(tài)的產(chǎn)品。

這種產(chǎn)品有自己非常明顯的一些特點(diǎn)：

第一、每一瓶都是真空，打開(kāi)蓋子能聽(tīng)到“嘭”的一聲。

第二、橡膠塞子帶導(dǎo)氣槽，和普通的塞子有明顯差別；

第三、里面的產(chǎn)品不是粉狀的，是塊狀物，左右搖晃很明顯；

第四、里面的塊狀物是速溶的，一秒即溶。

蛭弧菌原裝凍干粉最大的特點(diǎn)就是產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性非常好。

圖6 在不同時(shí)間點(diǎn)掃描蛭弧菌與大腸桿菌。蛭弧菌附著其獵物（10min≤t≤30min）、蛭質(zhì)體的形成和演化（t＞20min）、蛭質(zhì)體的溶解（t=3h）清晰可見(jiàn) [出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

11 蛭弧菌如何使用？

首先，購(gòu)買(mǎi)幾瓶產(chǎn)品，使用前檢測(cè)一次弧菌平板，使用48h后再檢測(cè)一次平板，至少2～3個(gè)試驗(yàn)組，同時(shí)一定要有對(duì)照組，通過(guò)試驗(yàn)看效果，如果有效，則建議再行使用。之所以要?jiǎng)澠桨?，因?yàn)轵位【皇侨f(wàn)能的，也不是在所有水體都可以存活的。

建議使用方法有這樣幾種：

一、在某些疾病發(fā)病高峰前的5～10d進(jìn)行使用，加大2～3倍劑量使用效果更好。

二、在蝦、蟹等甲殼類(lèi)動(dòng)物脫殼前5～10d使用，保護(hù)脆弱的脫殼期水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物。

三、在較長(zhǎng)陰雨天前5～10d使用，防止陰雨天滋生大量有害細(xì)菌。

四、某些養(yǎng)殖動(dòng)物剛發(fā)疾病，可以試著連用2d，每天1瓶?jī)龈煞塾?畝。

五、疾病已發(fā)，動(dòng)物開(kāi)始死亡，肯定首先要使用化學(xué)消毒劑，比如找到保真的過(guò)硫酸氫鉀，先消毒，間隔24h后再使用蛭弧菌進(jìn)行長(zhǎng)期控制。

六、可以和光合細(xì)菌進(jìn)行配合使用。

使用蛭弧菌的核心要求很清晰：一定要能長(zhǎng)期的幫助我們水產(chǎn)養(yǎng)殖控制總菌數(shù)、異養(yǎng)菌數(shù)甚至弧菌數(shù)的繁殖，將異養(yǎng)菌或者弧菌的生長(zhǎng)壓制到一定數(shù)量之下，防止它們達(dá)到暴發(fā)疾病的臨界值。

蛭弧菌雖然表達(dá)了很好的效果，但還要看一些公司的產(chǎn)品質(zhì)量，因此建議大家要會(huì)初步的使用平板，并且通過(guò)對(duì)比和多試驗(yàn)組判定效果。另外使用蛭弧菌也要記準(zhǔn)一點(diǎn)，不會(huì)有萬(wàn)能的產(chǎn)品，只會(huì)有合適的產(chǎn)品，多種方法、多種產(chǎn)品的配合可能會(huì)達(dá)到更好的效果。