鄭學(xué)殷　黃嘉樂(lè)　許志彬　李瑞玲　曾廣豐

摘????? 要：建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)食品接觸用紙和紙板中異噻唑啉酮類(lèi)殺菌劑含量進(jìn)行快速測(cè)定。樣品用甲醇重復(fù)提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，甲醇復(fù)溶，同時(shí)以回收率為指標(biāo)，結(jié)合響應(yīng)曲面分析優(yōu)化前處參數(shù)。以流動(dòng)注射方式優(yōu)化5種異噻唑啉酮類(lèi)化合物的質(zhì)譜參數(shù)，以電噴霧離子源正離子模式電離，結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定。5種異噻唑啉酮類(lèi)化合物在5.0～200 μg·L^-1范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.998 9，平均回收率為82.1%～95.2%，方法檢出限為5.0～10.0 μg·kg^-1，方法定量限為15.0～35.0 μg·kg^-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDs為5.15%～6.49%。該方法簡(jiǎn)單高效、回收率高、靈敏度高和重現(xiàn)性好均能達(dá)到分析測(cè)定要求，可用于食品接觸用紙和紙板中異噻唑啉酮類(lèi)殺菌劑的測(cè)定。

關(guān)? 鍵? 詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;食品接觸用紙和紙板;異噻唑啉酮;殺菌劑;響應(yīng)曲面優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.63; TS762.6 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A??? ??文章編號(hào)： 1671-0460（2020）06-1253-05

Optimization of Determination Conditions of Isothiazolinone Fungicides Residues in Food Contact Paper by Response Surface Methodology

ZHENG Xue-yin¹， HUANG Jia-le¹， XU Zhi-bin¹， LI Rui-ling²， ZENG Guang-feng³

（1. National Quality Testing Center for Processed Food （Guangdong）， Guangzhou Inspection and Testing Certification Group Company， Guangzhou Guangdong 511447， China;

2. SGS-CSTC Standards Technical Services Co.， Ltd.， Guangzhou Guangdong 510000， China;

3. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center， Guangzhou Guangdong 510623， China）

Abstract： A method for determination of isothiazolinone fungicides in food contact paper and cardboard by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was established. Samples were extracted by methanol repeatedly， then rotary evaporation was carried out to concentrate the samples， finally the samples were redissolved by methanol. The recovery rate was used as an indicator to optimize the pre-processing parameters with the response surface analysis. The mass spectrometry parameters of five isothiazolinone compounds were optimized by flow injection under positive mode of the electron spray ionization （ESI +） ， data of the analytes were obtained with mass spectrometric multiple reaction monitoring （MRM） mode. Five isothiazolinone compounds exhibited good linearity with correlation coefficient（r>0.998 9） when the concentrations ranged from 5.0 to 200 μg/L. The average recoveries of three spike levels were 82.1%～95.2%， while the limits of detection and the limits of quantitation were ranged 5.0～10.0 μg·kg^-1 and 15.0～35.0 μg·kg^-1， respectively. The relative standard deviations （RSDs） were ranged 5.15%～6.49%. This method is easy to operate， and its recovery， sensitivity and reproducibility could achieve the requirements of determination for isothiazolinone fungicides in food contact paper and cardboard.

Key words： Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Food contact paper and cardboard; Isothiazolinone; Fungicide; Response surface methodology

異噻唑啉酮類(lèi)殺菌劑是一種高效的廣譜殺菌劑，對(duì)細(xì)菌、真菌及藻類(lèi)等具有很強(qiáng)的抑制和殺滅作用^[1-2]，由于其具有低毒，高效、廣泛殺菌等特點(diǎn)，所以被優(yōu)良的殺菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)等生產(chǎn)領(lǐng)域的防霉防腐^[3]。但在工業(yè)生產(chǎn)的同時(shí)，環(huán)境的污染問(wèn)題也成為首要關(guān)注的問(wèn)題。由于其優(yōu)越性，在工業(yè)生產(chǎn)的過(guò)程中也很容易出現(xiàn)濫用的情況，由于大量的排放，導(dǎo)致了水體中的殘留^[4-5]。近年有研究報(bào)道顯示，異噻唑啉酮類(lèi)殺菌劑對(duì)人體皮膚會(huì)有過(guò)敏作用和炎癥效應(yīng)^[6-8]，對(duì)于食品接觸用紙的生產(chǎn)工業(yè)，若出現(xiàn)濫用的情況，對(duì)食品安全和消費(fèi)者的人身健康有可能會(huì)造成重大的威脅。

目前對(duì)于異噻唑啉酮類(lèi)殺菌劑的檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法^[9]、氣相色譜法^[10]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法^[11-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法^{[5，14，15]}。液相色譜法和氣相色譜法檢測(cè)成本較低，但儀器選擇性低，檢出限高，分析時(shí)間長(zhǎng)，雜質(zhì)較多，影響分析結(jié)果。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法利用四極桿對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行篩選分離，能大大降低雜質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的影響，同時(shí)，檢出限較低，對(duì)于監(jiān)管產(chǎn)品安全問(wèn)題，具有更廣泛的應(yīng)用。本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)5種異噻唑啉酮類(lèi)殺菌劑的殘留量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，經(jīng)方法學(xué)的數(shù)據(jù)分析，本方法回收率高，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適合在日常檢驗(yàn)中應(yīng)用，同時(shí)，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)^[16]，對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，可應(yīng)用于化工生產(chǎn)過(guò)程中的有毒有害物的監(jiān)控。

1? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧電離源（ESI）和MRM模式（4000Q，AB SCIEX公司）;電子天平;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為10 000 r/min;超聲波清洗器;渦旋混勻器。

1.2? 材料與試劑

食品接觸用紙和紙板樣品（購(gòu)自廣州市批發(fā)市場(chǎng)）;甲酸（色譜純，Aladdin）;甲醇、乙腈（HPLC，購(gòu)自賽默飛世爾公司）;標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、4，5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基異噻唑啉-3-酮、1，2-苯并異噻唑啉-3-酮、2-辛基-4-異噻唑啉-3-酮（DR，購(gòu)自安譜公司，純度均為≥98%）。

1.3? 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1? 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

基質(zhì)空白溶液：用5種異噻唑啉酮呈陰性的樣品進(jìn)行前處理，得到的溶液即為基質(zhì)空白溶液。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品于棕色容量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解，并用甲醇稀釋至刻度線，得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，質(zhì)量濃度為1 mg·mL^-1。該儲(chǔ)備溶液于2～8 ℃下避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取一定體積的每種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用甲醇和基質(zhì)空白溶液重新定容成適當(dāng)濃度為5，10，20，50，100，200 ?g·L^-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，曲線分別為溶劑曲線和基質(zhì)曲線，于4 ℃下避光保存。

1.3.2? 樣品前處理

將食品包裝紙或紙板剪成0.3 cm²大小的碎片，稱(chēng)取1 g （精確到0.01 g） 試樣置于具塞離心管中，加入10 mL 甲醇，超聲提取15 min。以10 000 r·min^-1 離心5 min，提取液倒入干凈的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，重復(fù)提取一次，提取液倒入同一個(gè)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑近干，用2 mL甲醇定容，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4? 儀器條件

1.4.1? 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C₁₈ （100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為5 μL;流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液（體積分?jǐn)?shù)），流速為0.5 mL·min^-1;采用梯度洗脫程序淋洗：0～3.0 min，50% A;3.0～5.0 min，50%～95% A;5.0～8.5 min，95% A;8.6～12.0 min，50% A;8.6～12.0 min，50% A。

1.4.2? 質(zhì)譜條件

LC-MS/MS 掃描方式：電噴霧電離源（ESI+）;氣簾氣：25 psi;電離電壓（IS）：4 500 V;離子源溫度（TEM）：550 ℃;霧化氣（GAS1）：50 psi;加熱輔助氣（GAS2）：50 psi;碰撞氣（CAD）：medium;采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。

1.5? 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)基于優(yōu)化后的甲醇用量，結(jié)合提取次數(shù)和超聲時(shí)間，設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，Box Behnken設(shè)計(jì)模型來(lái)設(shè)計(jì)提取因素條件，以提取次數(shù)（X₁），超聲時(shí)間（X₂， min），溶劑用量（X₃， mL） 三個(gè)因素為計(jì)變量，實(shí)驗(yàn)水平范圍見(jiàn)表1。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

由于5種異噻唑啉酮化合物均含有N原子，具有一定的電負(fù)性，在電噴霧正離子模式下更容易形成[M+H]⁺的準(zhǔn)分子離子峰，且豐度較高，因此選用正離子模式進(jìn)行測(cè)定。以流動(dòng)注射的方式將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源，并以正離子模式對(duì)母離子進(jìn)行掃描，確定母離子質(zhì)荷比后，進(jìn)行母離子的二級(jí)碎片掃描，選擇響應(yīng)值較高的兩個(gè)碎片作為定量和定性離子，最后通過(guò)（multiple reaction monitoring， MRM）模式分別對(duì)各個(gè)碎片的去簇電壓（declustering potential， DP）和碰撞電壓（collision energy， CE）進(jìn)行優(yōu)化，使各個(gè)碎片能達(dá)到較好的靈敏度。詳細(xì)見(jiàn)表2。5種異噻唑啉酮提取離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2? 提取溶劑的選擇

在實(shí)驗(yàn)前期對(duì)提取溶劑的選擇做了初步的選擇，由于5種異噻唑啉酮化合物具有一定的極性，因此選擇極性較大的溶劑有利于回收率的提高，最終選擇了甲醇和乙腈作為提取溶劑，并在提取兩次合并的情況下，以5種異噻唑啉酮的平均回收率作為考察依據(jù)，分別考察了甲醇和乙腈用量對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明，在同等用量的情況下，甲醇作為提取溶劑，回收率更高，同時(shí)當(dāng)甲醇用量達(dá)到10 mL時(shí)，5種異噻唑啉酮回收率達(dá)到了分析要求，而用量上升時(shí)，回收率差異不明顯，考慮到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的時(shí)間和耗材成本，最終選取10 mL甲醇提取兩次合并作為前處理?xiàng)l件，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖2。5種異噻唑啉酮在此條件下的回收率見(jiàn)圖3。

2.3? 基質(zhì)效應(yīng)

由于前處理方法采用甲醇直接提取，因此，提取液中雜質(zhì)較多，在質(zhì)譜中有可能存在基質(zhì)效應(yīng)從而影響目標(biāo)物離子化程度，所以對(duì)5種異噻唑啉酮的基質(zhì)效應(yīng)程度進(jìn)行了探究。

用基質(zhì)空白溶液配制單點(diǎn)混合標(biāo)準(zhǔn)液，計(jì)算得出的回收率K值。若基質(zhì)效應(yīng)不明顯，則此回收率應(yīng)為90%～110%之間。而單點(diǎn)基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中5種異噻唑啉酮的K值在為53%～73%，該前處理方法對(duì)5種異噻唑啉酮的分析具有較明顯的基質(zhì)效應(yīng)，采用基質(zhì)曲線進(jìn)行計(jì)算校正后，回收率達(dá)到日常檢驗(yàn)的要求。

2.4 ?響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)

為了優(yōu)化5種異噻唑啉酮的最佳提取條件，采用Box Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取次數(shù)（X₁），超聲時(shí)間（X₂，≠min），溶劑用量（X₃，≠mL）等3個(gè)提取條件。實(shí)驗(yàn)選擇回收率較低的2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮為代表分析對(duì)象，采用ANOVA方差分析對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

分析結(jié)果顯示，提取次數(shù)、超聲時(shí)間和溶劑用量的一次因素（檢驗(yàn)P值為0.000 1、0.002 2和0.001 0）和提取次數(shù)的二次因素（檢驗(yàn)P值為0.000 1）為顯著影響因素，缺省驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的P值為0.507 5，模型的P值為0.000 1，顯示顯著水平。根據(jù)系統(tǒng)推薦的二次方程進(jìn)行擬合，得到2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮的擬合曲線預(yù)測(cè)方程為（1），擬合相關(guān)系數(shù)R²為0.976 3。

y =89.30+6.58X₁+2.49X₂+2.86X₃+1.50X₁X₂+1.45X₁X₃+0.77X₂X₃-5.96X₁²-1.54X₂²-0.44X₃²。（1）

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后，以2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮代表分析物的回收率為基礎(chǔ)，進(jìn)行模型建立與預(yù)測(cè)，得到各個(gè)因素相應(yīng)的三維立體圖（圖4），能更直觀地分析相對(duì)較佳組合。結(jié)合檢測(cè)成本等因素考慮，最終選取提取條件為提取次數(shù)2次，超聲時(shí)間15 min，甲醇用量10 mL作為提取條件。在此因素水平組合下，5種異噻唑啉酮類(lèi)殺菌劑均獲得較好的平均回收率。

2.5? 方法的線性范圍和檢出限

在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，用基質(zhì)空白將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至5、10、20、50、100、200 ?g·L^-1進(jìn)行測(cè)定，以峰面積和濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，結(jié)果表明，擬合曲線線性良好（見(jiàn)表4），相關(guān)系數(shù)均大于0.998 9，方法的檢出限和定量限分別為5.0～10.0和15.0～35.0 μg·kg^-1，表明方法的靈敏度較好，可應(yīng)用于日常檢測(cè)。

2.6? 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)市售的產(chǎn)品進(jìn)行批量測(cè)定，為方便加標(biāo)水平的確定，選取陰性的樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn)，按照5種異噻唑啉酮最大定量限的1倍、2倍和5倍三個(gè)水平進(jìn)行添加，并對(duì)每一水平平行測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以考察實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。測(cè)定結(jié)果為平均回收率在82.1%～95.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.15%～6.49%。

結(jié)果表明，經(jīng)基質(zhì)曲線校正和響應(yīng)曲面優(yōu)化后的回收率能達(dá)到分析測(cè)定的要求，且精密度也較高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。詳細(xì)結(jié)果如表5所示。