陶然　王婭玲　李佳懌　劉富菁　陳美琦　王集會(huì)　張珊珊

摘????? 要： 為了研究全蝎白術(shù)白頭翁組方（SAPZF）發(fā)酵前后最佳萃取部位，采用球孢白僵菌雙向固體發(fā)酵技術(shù)制備全蝎白術(shù)白頭翁組方發(fā)酵物（SAPZFFW），分別制取組方發(fā)酵前后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%醇提液。采用系統(tǒng)萃取法，制得SAPZFFW、SAPZF的石油醚部、乙酸乙酯部、正丁醇部、水部干浸膏。通過(guò)MTT法檢測(cè)SAPZFFW、SAPZF不同極性部位對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用。結(jié)果表明：SAPZF有效部位的抗腫瘤能力由大到小依次為，石油醚部、正丁醇部、乙酸乙酯部;SAPZFFW有效部位抗腫瘤能力由大到小依次為，正丁醇部、石油醚部、乙酸乙酯部;SAPZFFW對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用優(yōu)于SAPZF，且正丁醇部效果較好。

關(guān)? 鍵? 詞：全蝎白術(shù)白頭翁;系統(tǒng)萃取法;極性部位;發(fā)酵;乳腺癌細(xì)胞株MCF-7

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?????? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）06-1154-04

Study on Extraction Technology of Scorpio， Atractylodes Macrocephalae Rhizoma and Radix Pulsatillae Prescription Before and After Fermentation

TAO Ran¹， WANG Ya-ling¹， LI Jia-yi¹， LIU Fu-jing¹ ， CHEN Mei-qi²， WANG Ji-hui³， ZHANG Shan-shan³

（1. School of Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China;

2. College of traditional Chinese Medicine， Shandong University of traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China;

3. Experimental Center， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： In order tostudy the optimum extraction site of Scorpio， Atractylodes Macrocephalae Rhizoma and Radix Pulsatillae Prescription （SAPZF） before and after fermentation， SAPZFFW （fermentation product of SAPZF） was prepared by the two-way solid fermentation of Beauveria bassiana.The 75% alcohol extract of the SAPZFFW and SAPZF were subsequently obtained.Their dry extracts of petroleum ether part， ethyl acetate part， n-butanol part and water part were prepared by system extraction， respectively. Their inhibitions on breast cancer cell line MCF-7 were assayed by MTT for different polar sites. The anti-tumor ability of SAPZF effective site in order from large to small was determined as follows： petroleum ether part > n-butanol part > ethyl acetate part. That of SAPZFFW was determined as follows： n-butanol part > petroleum ether part > ethyl acetate part. The inhibitory effect of SAPZFFW on breast cancer cell line MCF-7 was better than that of SAPZF， and the effect of n-butylalcohol part was better.

Key words： Scorpio; Atractylodes macrocephalae rhizoma and radix pulsatillae; System extraction; Polar region; Fermentation;breast cancer cell line MCF-7

2.4? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析的基礎(chǔ)上的q檢驗(yàn)。p<0.01表示有極顯著性差異，p<0.05表示有顯著性差異。

3? 結(jié)果

3.1? SAPZF不同極性部位對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用

由圖1可知，在供試藥液質(zhì)量濃度0.03～0.50 mg·mL^-1范圍內(nèi)，SAPZF的乙酸乙酯部與水部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制率均較低，乙酸乙酯部只有在質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg·mL^-1以上時(shí)其抑制率才開(kāi)始逐漸上升至47%左右，水部抑制率基本在10%上下徘徊，而SAPZF的石油醚部與正丁醇部均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.25 mg·mL^-1時(shí)，石油醚部的抑制率達(dá)到最高（89.88%）;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.50 mg·mL^-1時(shí)，正丁醇部的抑制率達(dá)到最高（87.67%）。

由此可知，水部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7幾乎無(wú)抑制作用，石油醚部、正丁醇部、乙酸乙酯部均為SAPZF抗腫瘤的有效部位，且抗腫瘤能力由大到小依次為：石油醚部、正丁醇部、乙酸乙酯部。

3.2? SAPZFFW不同極性部位對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用

由圖2可知，在供試藥液質(zhì)量濃度0.03～0.50 mg·mL^-1范圍內(nèi)，SAPZFFW的水部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7幾乎無(wú)抑制作用，而SAPZFFW的石油醚部、乙酸乙酯部以及正丁醇部表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。尤其是正丁醇部，在各試驗(yàn)藥物濃度下，均表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制率最高可達(dá)95.24%。由此可知，石油醚部、乙酸乙酯部以及正丁醇部均為SAPZFFW抗腫瘤的有效部位，且抗腫瘤能力由大到小依次為：正丁醇部、石油醚部、乙酸乙酯部。

3.3? SAPZFFW、SAPZF有效部位顯著性分析

3.3.1 ?SAPZFFW、SAPZF醇提物石油醚部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用

SAPZF與SAPZFFW石油醚部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用見(jiàn)圖3。當(dāng)試驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度為0.03、0.06、0.13 mg·mL^-1時(shí)，SAPZFFW石油醚部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用均優(yōu)于SAPZF石油醚部，且兩者具有極顯著性差異。（**p<0.01;*p<0.05）

3.3.2? SAPZFFW、SAPZF醇提物乙酸乙酯部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用

SAPZF與SAPZFFW乙酸乙酯部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用見(jiàn)圖4。在試驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度0.03 ～0.50 mg·mL^-1范圍內(nèi)，SAPZFFW乙酸乙酯部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用均優(yōu)于SAPZF乙酸乙酯部，且兩者具有極顯著性差異（**p<0.01;*p<0.05）。

3.3.3 ?SAPZFFW、SAPZF醇提物正丁醇部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用

SAPZF與SAPZFFW正丁醇部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用見(jiàn)圖5。在試驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度0.03 ～0.25 mg·mL^-1范圍內(nèi)，SAPZFFW正丁醇部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用均優(yōu)于SAPZF正丁醇部，且兩者具有極顯著性差異（**p<0.01;*p<0.05）。

3.3.4? SAPZFFW、SAPZF醇提物水部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用

SAPZF與SAPZFFW水部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用見(jiàn)圖6。在低質(zhì)量濃度時(shí)（<0.50 mg·mL^-1），SAPZFFW水部對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7幾乎無(wú)抑制作用，而當(dāng)藥物濃度達(dá)到1.00 mg·mL^-1時(shí)，SAPZFFW水部對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)到61.97%，與SAPZF水部相比，兩者具有極顯著性差異（**p<0.01;*p<0.05）。

4? 結(jié)束語(yǔ)

全蝎含蝎毒蛋白、游離氨基酸、組織胺及膽甾醇、脂肪酸等水溶性和脂溶性成分^[7]。白術(shù)中含揮發(fā)油、黃酮類(lèi)，倍半萜內(nèi)酯化合物、多炔醇類(lèi)化合物等，白術(shù)內(nèi)酯為主要活性成分，對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Hela，肺癌細(xì)胞株A549具有抑制生長(zhǎng)作用^[8]。白頭翁的主要成分有三萜皂苷、三萜酸、香豆素等成分。且三萜皂苷具有抗腫瘤作用^[9]。三者組成的方劑中，既有極性成分如蝎毒蛋白、氨基酸、三萜皂苷等水溶性成分，又有黃酮、白術(shù)內(nèi)酯等脂溶性成分，所含成分復(fù)雜。球孢白僵菌作為一種生物催化劑，可與黃酮類(lèi)、萜類(lèi)化合物等發(fā)生羥基化反應(yīng)，與有機(jī)酸、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)等化合物發(fā)生糖基化反應(yīng)^[10]，也可以通過(guò)本身所產(chǎn)生的蛋白酶將發(fā)酵菌質(zhì)中的蛋白類(lèi)成分酶解、通過(guò)自身產(chǎn)生的聚酮合酶合成白僵菌素、環(huán)孢菌素等非核糖體肽。經(jīng)研究表明：SAPZF抗腫瘤的有效部位為石油醚部、正丁醇部，且抗腫瘤能力由大到小依次為：石油醚部、正丁醇部;SAPZFFW抗腫瘤的有效部位為石油醚部、乙酸乙酯部以及正丁醇部，抗腫瘤能力由大到小依次為：正丁醇部、石油醚部、乙酸乙酯部。其中，正丁醇部在試驗(yàn)藥物濃度0.03 ～0.5 mg/mL范圍內(nèi)均具有良好的抗腫瘤作用。同時(shí)，SAPZFFW在各極性部位對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用優(yōu)于SAPZF，藥用基質(zhì)經(jīng)發(fā)酵后，其成分的極性也發(fā)生了改變，提高了中、低極性的脂溶性物質(zhì)的含量與藥效。其原因一方面可能是藥性培養(yǎng)基質(zhì)中的蛋白類(lèi)成分由大分子的蛋白酶解為小分子的多肽和寡肽從而增強(qiáng)了其藥理活性，因?yàn)榻?jīng)過(guò)75%乙醇的提取，10 KDa相對(duì)分子量以上的大蛋白被沉淀過(guò)濾除掉，而10 KDa以下的小分子多肽和寡肽溶于75%乙醇而得以保留，正是這部分極性成分的增加，使得抗腫瘤活性得到加強(qiáng)。另一方面，可能球孢白僵菌在發(fā)酵的過(guò)程中產(chǎn)生了具有藥理活性的水溶性的次生代謝物質(zhì)或是其對(duì)藥性培養(yǎng)基質(zhì)中的物質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾與轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)了活性成分的抗腫瘤作用。有關(guān)生物轉(zhuǎn)化機(jī)理有待于今后進(jìn)一步的深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]張瑞，楊培，毛會(huì)秀，等. 全蝎白術(shù)白頭翁混合發(fā)酵品不同極性部位體外抗病毒研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2019，30（1）：62-64.

[2]劉金虎，田志龍，毛會(huì)秀，等. 全蝎白術(shù)白頭翁混合發(fā)酵物超聲水提工藝的優(yōu)化及體外抗腫瘤活性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2019，34（4）：383-387.

[3]劉鑫，侯若琳，劉建兵，等. 球孢白僵菌深層發(fā)酵液抗乳腺癌活性部位篩選及成分分析[J].菌物學(xué)報(bào)，2017，36（12）：1659-1666.

[4]莊毅. 藥用真菌新型（雙向型）固體發(fā)酵工程[J]. 中國(guó)食用菌，2002，21（4）：3.

[5]孫靜，王集會(huì).全蝎三種產(chǎn)地加工方法的對(duì)比研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18（7）：903-906.

[6]劉金虎，趙翠燕，孫志藝，等. 全蝎白術(shù)白頭翁組合發(fā)酵品不同醇濃度提取物的活性成分分析及體外藥理研究[J].當(dāng)代化工， 2019，48（6）：383-387.

[7]吳福林，董慶海，王涵，等.中藥全蝎研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，20（12）：108.

[8]張曉娟，左東東.白術(shù)化學(xué)成分及藥理作用研究新進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2018，35（6）：101-102.

[9]李春曉，王月明，韋東來(lái)，等.白頭翁藥理作用的研究進(jìn)展[J].植物醫(yī)生，2018，31（8）：26-29.

[10]王美欣，胡海峰，薛亞平.球孢白僵菌在生物催化反應(yīng)中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)與生物工程，2018，35（8）：14-18.