閆明雪　王倩倩　楊銘哲　薛文靜　史磊　趙盼

摘????? 要：為了研究核桃楸皮總黃酮的抗氧化活性和體外總還原能力，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%的乙醇回流提取核桃楸皮總黃酮，并用HPD-750型大孔樹(shù)脂純化核桃楸皮總黃酮;利用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測(cè)定核桃楸皮總黃酮的質(zhì)量濃度;通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)和還原力實(shí)驗(yàn)研究核桃楸皮總黃酮的抗氧化活性和體外總還原能力。結(jié)果表明：提取物經(jīng)HPD-750型大孔樹(shù)脂純化后所得的總黃酮粉末純度為（72.02±4.01）%;核桃楸皮總黃酮對(duì)DPPH 自由基的半抑制質(zhì)量濃度IC₅₀為2.068 ?g·mL^-1，對(duì)超氧陰離子自由基的半抑制質(zhì)量濃度IC₅₀為273.253 ?g·mL^-1;還原力實(shí)驗(yàn)中，核桃楸皮總黃酮質(zhì)量濃度為1 mg·mL^-1時(shí)吸光度為2.094 4;經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，核桃楸皮總黃酮的抗氧化活性與總黃酮質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。體外抗氧化試驗(yàn)表明核桃楸皮總黃酮具有較好的體外抗氧化活性，以期為食品工業(yè)新型抗氧化劑、抗氧化食品以及抗氧化藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

關(guān)? 鍵? 詞：核桃楸皮;總黃酮;提取純化;抗氧化

中圖分類號(hào)：R284?????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?????? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）06-1051-05

Antioxidant Activity In Vitro of Total Flavonoids?From Cortex Juglandis Mandshuricae

YAN Ming-xue， WANG Qian-qian， YANG Ming-zhe， XUE Wen-jing， SHI Lei， ZHAO Pan^*

（College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： To study the antioxidant activity and total reduction capacity in vitro of total flavonoids （TFs） from Cortex Juglandis Mandshuricae （CJM），TFs were extracted from CJM by 70% ethanol and purified by HPD-750 macroporous resin. The system of NaNO₂-Al（NO₃）₃-NaOH was used to determine the content of TFs from CJM. The antioxidant activity and total reduction capacity of TFs from CJM were studied by DPPH free radical scavenging experiments， superoxide anion radical scavenging experiments and reducing power experiments. The results showed that， after the extract was purified by HPD-750 macroporous resin， the content of TFs powder obtained was （72.02±4.01）%. The half inhibitory concentration （IC₅₀） of DPPH free radicals by TFs from CJM was 2.068 ?g·mL^-1， and the half inhibitory concentration （IC₅₀） of superoxide anion radicals was 273.253 ?g·mL^-1. In the reducing power experiment， the absorbance was 2.0944 when the TFs content from CJM was 1 mg·mL^-1. After statistical analysis， there was a significant positive correlation between the antioxidant activity and the content of TFs from CJM （P<0.05）. So TFs from CJM had good antioxidant activity in vitro. The paper can provide theoretical basis for the research and development of new antioxidants for antioxidant foods and antioxidant drugs.

Key words： Cortex Juglandis Mandshuricae; Total flavonoids; Extraction and purification; Antioxidant

核桃楸（Juglandis Mandshuricae）屬胡桃科胡桃屬植物，主要分布于我國(guó)東北、華北地區(qū)，是十分珍貴的藥源植物，開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景廣闊^[1]。核桃楸皮（Cortex Juglandis Mandshuricae）為核桃楸的莖皮和枝皮^[2]，富含黃酮類、醌類、萜類、二芳基庚烷類、多酚類等多種化學(xué)成分^[3]，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性^[4]，在食品、藥品等領(lǐng)域都具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

黃酮類化合物普遍存在于自然界中，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性^[5]，但目前針對(duì)核桃楸皮的研究多集中在醌類物質(zhì)及抗腫瘤方面，對(duì)核桃楸皮總黃酮抗氧化活性的研究少見(jiàn)報(bào)道^[6-7]。因此，加快核桃楸皮總黃酮抗氧化活性的研究，對(duì)核桃楸皮的深度開(kāi)發(fā)與利用具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1? 試驗(yàn)

1.1? 儀器

GFL-230型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;QE-300型高速粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司;FA1204B電子天平，上海天美天平儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司;DLSB-ZC型低溫循環(huán)真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;YRE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;KQ-500GVDV型雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;LGJ-18型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;UV9100B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) ，北京萊伯泰科儀器有限公司;TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;PHS-25型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2? 材料與試劑

核桃楸皮，安國(guó)市昌達(dá)中藥材飲片有限公司;HPD-750型大孔樹(shù)脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所研制;抗壞血酸，天津市福晨化學(xué)試劑廠;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、DPPH、無(wú)水乙醇、濃鹽酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，均為國(guó)產(chǎn)、分析純。

2? 方法

2.1? 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，參考李學(xué)玲^[8]等的方法稍做改變。取2 mL 200 ?g·mL^-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的NaNO₂ 溶液0.5 mL，搖勻后靜置8 min;再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的Al（NO₃）₃ 溶液0.5 mL，搖勻后靜置6 min;然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% 的NaOH溶液4.0 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容，搖勻后放置10 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白調(diào)基線，用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)為510 nm。光譜掃描如圖1所示。

準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，按上述操作步驟進(jìn)行顯色反應(yīng)，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白，在510 nm處測(cè)量吸光度。繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2.2? 核桃楸皮總黃酮的提取

參考何微^[9]等的總黃酮提取工藝稍做修改。將干燥至恒重的核桃楸皮粉碎，過(guò)100目篩（孔徑? 0.15 mm）得核桃楸皮粉末307.7 g，加入15倍量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在80 ℃水浴下回流提取? 1.5 h，提取兩次。將提取液抽濾，合并兩次濾液，得核桃楸皮粉末的醇提液。將醇提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃下減壓回收乙醇至無(wú)醇味，即得。

2.3? 核桃楸皮總黃酮的純化

大孔吸附樹(shù)脂具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、再生處理方便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取、分離、純化工作中^[10]。大孔吸附樹(shù)脂的吸附性是其與被吸附物質(zhì)分子間的范德華力以及形成氫鍵而產(chǎn)生的，即一種通過(guò)巨大的比表面積而進(jìn)行的物理吸附。由于提取液中的化學(xué)成分復(fù)雜繁多，分子量和吸附力各不相同，因此被吸附成分經(jīng)過(guò)一定的溶劑洗脫，可以先后從大孔樹(shù)脂上被洗脫下來(lái)，達(dá)到分離、純化物質(zhì)的目的^[11]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)，選用HPD-750型大孔樹(shù)脂對(duì)核桃楸皮總黃酮進(jìn)行純化。控制上樣質(zhì)量濃度約5 mg·mL^-1，樣液以2 BV/h的流速流過(guò)樹(shù)脂柱，最大上樣量7 BV，靜置，吸附4 h后用蒸餾水淋洗樹(shù)脂柱至流出液澄清，再用8 BV體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。

2.4? 核桃楸皮總黃酮粉末的制備

將核桃楸皮總黃酮純化后的洗脫液在60 ℃下減壓旋蒸，得到核桃楸皮總黃酮濃縮提取液，經(jīng)冷凍干燥后得核桃楸皮總黃酮粉末31.70 g。

2.5? 總黃酮粉末純度的測(cè)定

取黃酮粉末5.3 mg，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇定容到25 mL容量瓶中，得到總黃酮溶液。移取5 mL總黃酮溶液于25 mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的NaNO₂溶液0.5 mL，搖勻后靜置8 min;再加入質(zhì)量濃度為10%的 Al（NO₃）₃ 溶液0.5 mL，搖勻后靜置6 min;然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% NaOH溶液4.0 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇定容，即得待測(cè)樣品。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇為空白，在510 nm處平行3次測(cè)得吸光度為0.424 4±0.009 2，利用工作曲線計(jì)算樣品質(zhì)量濃度為（30.53±1.70）?g·mL^-1。最終計(jì)算得到核桃楸皮總黃酮粉末的純度為（72.02±4.01）%。

式中：C —待測(cè)樣品的質(zhì)量濃度，?g·mL^-1;

V — 待測(cè)樣品的體積，mL。

2.6? 對(duì)DPPH自由基的清除率測(cè)定

參考楊永濤^[12]的方法，并稍加修改。精確稱量黃酮粉末0.013 9 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇定容到100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為100 ?g·mL^-1的核桃楸皮總黃酮溶液，分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL總黃酮溶液于25 mL容量瓶中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16 ?g·mL^-1的核桃楸皮總黃酮溶液。分別取上述不同質(zhì)量濃度溶液?? 2 mL，置于8個(gè)10 mL比色管中，然后分別加入??????? 0.1 mmol·L^-1 DPPH溶液2 mL，混合搖勻，37 ℃水浴下避光放置30 min后，于517 nm處測(cè)定吸光度值A_x，以2 mL無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，測(cè)得吸光度A₁，以2 mL無(wú)水乙醇代替樣品溶液，測(cè)得吸光度 A₀。每一吸光度平行測(cè)定3次，取平均值。以相同質(zhì)量濃度的VC作陽(yáng)性對(duì)照。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)DPPH自由基的清除率為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。對(duì)DPPH自由基的清除率計(jì)算公式如下：

2.7? 對(duì)超氧陰離子自由基（O₂^-·）的清除作用測(cè)定

參考單科開(kāi)^[13]等的方法，采用鄰苯三酚自氧化法，取4.5 mL質(zhì)量濃度為50 mmol·L^-1 Tris-HCl緩沖液（pH=8.2）于10 mL比色管中，加入4 mL蒸餾水，均勻混合后于28 ℃條件下水浴20 min。隨后快速加入在28 ℃水浴中預(yù)熱的3 mmol·L^-1鄰苯三酚溶液0.5 mL，迅速搖勻倒入比色皿中，用10 mmol·L^-1 HCl溶液作為空白調(diào)零，于325 nm波長(zhǎng)處每間隔30 s測(cè)量該溶液的吸光度值，共測(cè)量4 min，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線，其斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率V₀。用4 mL質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 ?g·mL^-1的核桃楸皮總黃酮溶液代替4 mL蒸餾水，按照同樣的方法繪制線性回歸曲線，其斜率記為V_x。對(duì)超氧陰離子自由基的清除率計(jì)算公式如下：

2.8? 總還原力的測(cè)定

參考馮小雨^[14]等的方法測(cè)定核桃楸皮總黃酮的總還原能力。配制質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·mL^-1的核桃楸皮總黃酮醇溶液，分別取1 mL放入5個(gè)離心管中，再在每個(gè)離心管中各加入2.5 mL 0.2 mol·L的磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）與2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的鐵氰化鉀溶液，混勻后在50 ℃條件下水浴30 min，再加入2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸，并在5 000 r·min^-1的條件下離心10 min，分別取2.5 mL上清液于5個(gè)比色管中，依次加入2.5 mL蒸餾水與0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氯化鐵溶液，反應(yīng)10 min后，以蒸餾水為空白調(diào)零，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，平行測(cè)定3次，以相同質(zhì)量濃度的 VC 為陽(yáng)性對(duì)照。

2.9? 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22軟件計(jì)算核桃楸皮總黃酮和VC對(duì)自由基清除能力的IC₅₀，利用Pearson法進(jìn)行抗氧化活性與總黃酮質(zhì)量濃度的相關(guān)性分析。

3? 結(jié)果與分析

3.1? 核桃楸皮總黃酮清除DPPH自由基能力

DPPH自由基在乙醇溶液中呈紫色，在517 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，其吸光度與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當(dāng)在其中加入抗氧化物質(zhì)時(shí)，抗氧化物質(zhì)會(huì)與DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)，使自由基的數(shù)量減少，溶液顏色變淺，在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度降低。因此抗氧化能力越強(qiáng)，DPPH溶液在517 nm處吸光度越小，抗氧化物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率越高^[15]。核桃楸皮總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率如圖3所示。

核桃楸皮總黃酮和VC的自由基清除能力IC₅₀值如表1所示。核桃楸皮總黃酮對(duì)DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度IC₅₀值為2.068 ?g·mL^-1，VC對(duì)DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度IC₅₀值1.911 ?g·mL^-1。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到16 ?g·mL^-1時(shí)，VC 對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到96.30%，核桃楸皮總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到93.27%，這說(shuō)明核桃楸皮總黃酮具有顯著的清除DPPH自由基的能力。

3.2? 核桃楸皮總黃酮清除超氧陰離子自由基能力

鄰苯三酚在弱堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，生成超氧陰離子自由基以及有色中間體，該有色中間體在325 nm處有最大吸收。若加入抗氧化物質(zhì)，將會(huì)清除超氧陰離子自由基，阻礙有色中間體的積累，因此可以通過(guò)溶液在325 nm下吸光度值的變化反映核桃楸皮總黃酮清除超氧陰離子自由基的能力^[16]。核桃楸皮總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除率如圖4所示。

核桃楸皮總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的半抑制質(zhì)量濃度IC₅₀值為273.253 ?g·mL^-1，高于VC對(duì)超氧陰離子自由基的半抑制質(zhì)量濃度IC₅₀值41.299 ?g·mL^-1。在20～100 ?g·mL^-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC 對(duì)超氧陰離子的清除率最高可達(dá)到97.71%，而核桃楸皮總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除率最高為23.08%，說(shuō)明核桃楸皮總黃酮具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，但弱于陽(yáng)性對(duì)照 VC。

3.3? 核桃楸皮總黃酮的總還原能力

抗氧化物質(zhì)具有還原能力，當(dāng)在體系中加入抗氧化物質(zhì)時(shí)，[Fe（CN）₆]^3- 會(huì)被還原成 [Fe（CN）₆]^4-，酸性條件下，F(xiàn)e³⁺ 與 [Fe（CN）₆]^4- 反應(yīng)生成深藍(lán)色的沉淀，被稱為普魯士藍(lán)（Fe₄[Fe（CN）₆]₃）。普魯士藍(lán)在700 nm處有最大吸收，其吸光度可以衡量普魯士藍(lán)的質(zhì)量濃度，進(jìn)而表示還原能力，以還原能力來(lái)反映物質(zhì)的抗氧化活性，即吸光度越大，抗氧化能力越強(qiáng)^[17]。核桃楸皮總黃酮的總還原能力如圖5所示。

在考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，核桃楸皮總黃酮的總還原能力增強(qiáng)，即總黃酮質(zhì)量濃度與總還原能力之間有顯著的正相關(guān)性（P<0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度增大到1 mg·mL^-1時(shí)，VC 的吸光度為2.345 9，核桃楸皮總黃酮的吸光度為2.094 4，即核桃楸皮總黃酮具有良好的總還原能力。

3.4? 核桃楸皮總黃酮的質(zhì)量濃度與清除自由基能力的相關(guān)性分析

核桃楸皮總黃酮的質(zhì)量濃度與清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基能力的相關(guān)性分析如表2所示。通過(guò)Pearson分析，核桃楸皮總黃酮的質(zhì)量濃度與其清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基的能力存在顯著正相關(guān)，即核桃楸皮總黃酮的質(zhì)量濃度越高，其清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基的能力越強(qiáng)，量效關(guān)系明顯。

4? 結(jié)束語(yǔ)

本研究利用乙醇加熱回流提取核桃楸皮中的總黃酮，利用HPD-750 型大孔吸附樹(shù)脂純化總黃酮，得到的核桃楸皮總黃酮粉末純度為（72.02±4.01）%。利用 DPPH法檢測(cè)核桃楸皮總黃酮清除 DPPH 自由基的能力，在設(shè)置的質(zhì)量濃度梯度中，核桃楸皮總黃酮對(duì) DPPH自由基的清除力隨著核桃楸皮總黃酮質(zhì)量濃度的增大而增大，與陽(yáng)性對(duì)照 VC 對(duì)比，清除能力顯著;利用鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)核桃楸皮總黃酮清除超氧陰離子自由基的能力，在設(shè)置的質(zhì)量濃度梯度中，核桃楸皮總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除力隨著核桃楸皮總黃酮質(zhì)量濃度的增大而增大，與陽(yáng)性對(duì)照 VC 對(duì)比，其具有一定的清除能力。經(jīng)相關(guān)性分析，核桃楸皮總黃酮的清除自由基的能力與總黃酮質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。利用普魯士藍(lán)法檢測(cè)核桃楸皮總黃酮的總還原能力，總還原能力隨著核桃楸皮總黃酮質(zhì)量濃度的增大而增大，在0.50～1.00 mg·mL^-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，核桃楸皮總黃酮表現(xiàn)出顯著的總還原能力。綜上所述，核桃楸皮總黃酮具有良好的抗氧化性。

本試驗(yàn)結(jié)果證明，核桃楸皮總黃酮具有較好的抗氧化作用，可以作為良好的抗氧化劑。由于中藥的抗輻射損傷可以通過(guò)抗氧化作用實(shí)現(xiàn)，因此研究具有抗氧化作用的中藥成分逐漸成為醫(yī)療和保健品行業(yè)的熱點(diǎn)問(wèn)題^[18]，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可為核桃楸皮總黃酮在抗氧化新藥的研發(fā)、功能性保健品的開(kāi)發(fā)等方面提供理論支持。

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