陳真真 周國勤 陳新宏 謝旭東 陳金平

摘要：以轉(zhuǎn)華山新麥草果聚糖合成酶基因（HS-6-SFT）煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草W38為材料，在4℃低溫下對其脅迫8h，分析轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的變化。結(jié)果表明，在低溫脅迫下煙草葉片中的SOD活性、CAT活性、POD活性和可溶性蛋白質(zhì)含量均有所增加，且增加的幅度要大于常溫處理，并且在轉(zhuǎn)基因材料和對照之間存在極顯著差異（P<0.01）。轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因增強(qiáng)了煙草的杭逆性。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因煙草;超氧化物歧化酶（SOD）;過氧化氫（CAT）;過氧化物（POD）;可溶性蛋白質(zhì);低溫脅迫

中圖分類號：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）09-0095-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.019

果聚糖（fructans）為水溶性的非還原性多糖，是由蔗糖與1個或多個果糖基相連接而形成的聚合物，廣泛存在于各種真菌、細(xì)菌和植物中。植物是果聚糖的主要來源，目前已發(fā)現(xiàn)植物的果聚糖主要有5種類型[1]。果聚糖是植物體內(nèi)一種貯藏性碳水化合物，同時也具有滲透調(diào)節(jié)作用，與植物的抗逆性密切相關(guān)。

將來自微生物的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（SacB基因）轉(zhuǎn)入煙草（Nicotiana tobacum）、甜菜（Beta vulgar-is）、小麥（Triticum aestivum）、番茄（Lycopersicon escul-entum）后，植株的抗寒性[2-4]、耐鹽性[5]和抗旱性[6-8]均明顯提高。王關(guān)林等[4]將果聚糖合成酶基因轉(zhuǎn)入番茄，利用Southern、RT-PCR等技術(shù)對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，結(jié)果表明果聚糖合成酶基因的轉(zhuǎn)入增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因番茄的抗寒性。劉偉華等[7]以來自枯草桿菌的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因SacB基因轉(zhuǎn)化小麥，獲得了耐旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，表明細(xì)菌來源的SacB基因能夠提高小麥的耐旱性。Kawakami等[9]將小麥中wft1（1-FFT）基因和wft2（1-SST）基因轉(zhuǎn)入水稻，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因水稻植株的成熟葉片中發(fā)現(xiàn)了大量的果聚糖積累，并在幼苗時期表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性。另有研究者將從萵苣中克隆的1-SST基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株抗旱性和抗寒性均明顯提高[10]。

隨著植物中第一個果聚糖合成酶基因在大麥中成功克隆，已在多種植物中克隆了果聚糖合成酶基因，并進(jìn)行了相關(guān)功能驗(yàn)證叫。但是，鮮見有關(guān)華山新麥草6-SFT蔗糖：果聚糖-6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因）基因在干旱和寒冷脅迫抗性中的作用及其轉(zhuǎn)基因植株在逆境脅迫下的生理生化反應(yīng)的報道。為此，本研究以轉(zhuǎn)化小麥近緣屬華山新麥草6-SFT基因煙草為材料，通過低溫脅迫處理，旨在了解轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草其抗逆性是否增強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草為陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，以非轉(zhuǎn)基因煙草W38作為對照。試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院進(jìn)行。

1.2 材料的選取

將大小基本一致的陽性轉(zhuǎn)基因植株和對照植株移栽至10cm×10cm塑料盆中。每個品種各栽5株，待植株長至3～5片真葉時，在4℃低溫下對其脅迫8h，取處理煙草第三和第四片葉速凍于液氮中，儲存于-80℃的冰箱中備用。每個樣本測3次，各指標(biāo)取3次測定的平均值。

1.3 生理生化指標(biāo)測定

過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和可溶性蛋白質(zhì)的測定分別采用愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法、氮藍(lán)四唑法和考馬斯亮藍(lán)G-250法[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的輸入、作圖，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草中可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

煙草中可溶性蛋白質(zhì)含量變化如圖1。從圖1可以看出，在4℃低溫脅迫處理下，轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草和對照可溶性蛋白質(zhì)含量都增加。在25℃下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草和對照可溶性蛋白質(zhì)含量差別不大，但4℃低溫下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草可溶性蛋白質(zhì)含量是25℃下的2.29倍，對照可溶性蛋白質(zhì)含量是25℃下的2.19倍。在4℃低溫下轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性蛋白質(zhì)含量與對照差異極顯著（P<0.01）?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量與植物的抗寒性密切相關(guān)，在低溫脅迫處理下轉(zhuǎn)基因煙草可溶性蛋白質(zhì)含量明顯提高，使其細(xì)胞液濃度升高，由此說明轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草的抗寒性提高了。

2.2 煙草中POD活性的變化

由圖2可以看出，在4℃低溫處理下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草和對照POD活性都有增加。在25℃下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草和對照POD活性差別不大，但4℃低溫下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草POD活性是25℃下的2.46倍，對照POD活性是25℃下的1.50倍。在4℃脅迫時轉(zhuǎn)基因煙草POD活性與對照差異極顯著（P<0.01）。在低溫、干旱和鹽漬等條件下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的H₂O₂，這些H₂O₂由于比較活潑的化學(xué)性質(zhì)結(jié)合體內(nèi)的自由基而產(chǎn)生一些過氧化物，從而對植物體產(chǎn)生傷害，而POD可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基和過氧化物，分解植物體內(nèi)的H₂O₂，避免細(xì)胞膜受到傷害，減輕H₂O₂對植物的傷害，由此說明低溫脅迫可導(dǎo)致轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草POD活性增加。

2.3 煙草中SOD活性的變化

由圖3可知，在4℃低溫處理下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草和對照SOD活性都有增加。在25℃下轉(zhuǎn)基因煙草和對照SOD活性基本在一個水平，但4℃低溫下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草SOD活性是25℃下的2.78倍，對照SOD活性是25℃下的1.24倍。在4℃脅迫時轉(zhuǎn)基因煙草SOD活性與對照差異極顯著（P<0.01）。SOD在植物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)中是最重要的保護(hù)酶之一，在低溫脅迫下SOD作為植物抗寒性的重要指標(biāo)，SOD活性越高表明該植物的抗寒性越強(qiáng)，SOD活性越低表明該植物的抗寒性越弱，由圖3可知，轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草在低溫處理下SOD活性增強(qiáng)，由此表明轉(zhuǎn)入的HS-6-SFT基因提高了煙草的抗寒性。

2.4 煙草中CAT活性的變化

轉(zhuǎn)基因煙草CAT活性變化如圖4。從圖4可以看出，在4℃低溫處理下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草和對照CAT活性都有所增加。在25℃下轉(zhuǎn)基因煙草和對照CAT活性基本在一個水平，但4℃低溫下轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草CAT活性是25℃下的1.77倍，對照CAT活性是25℃下的1.10倍。在4℃脅迫時轉(zhuǎn)基因煙草的CAT活性與對照差異極顯著（P<0.01）。在低溫逆境脅迫下，大量的活性氧在植物體內(nèi)產(chǎn)生，形成過氧化環(huán)境，氧具有非?；顫姷幕瘜W(xué)性質(zhì)，氧所催化的化學(xué)反應(yīng)會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，因此及時清除活性氧可以提高植物的抗逆性，由此說明轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草抗逆性有所提高。

3 小結(jié)與討論

Hisano等[13]利用基因槍法將小麥中的果糖基合成酶基因轉(zhuǎn)入多年生黑麥草中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因黑麥草表現(xiàn)出較高的抗寒性。Kawakami等[9]將小麥中的1-SST基因和6-SFT基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻，在轉(zhuǎn)基因水稻葉中檢測到果聚糖的存在，對轉(zhuǎn)基因水稻和對照進(jìn)行冷害處理，對照存活率低于10%，而所有轉(zhuǎn)1-SST株系及一個轉(zhuǎn)6-SFT株系水稻存活率均高達(dá)40%～90%。李慧娟等[10]、Li等[14]將從萵苣中克隆的1-SST基因轉(zhuǎn)入煙草，結(jié)果表明耐旱性及其抗凍性顯著提高，表明轉(zhuǎn)1-SST基因煙草植株積累了果聚糖。本研究將小麥近緣屬華山新麥草6-SFT基因轉(zhuǎn)入到煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱和抗低溫能力，進(jìn)一步表明來自小麥近緣屬華山新麥草的果聚糖合成酶基因的過表達(dá)可以提高植物的抗逆性，這將為利用生物技術(shù)手段改良小麥的抗逆性提供新的理論和方法。

試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草一方面通過增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白質(zhì)）的含量，保持原生質(zhì)體與環(huán)境之間的滲透平衡和結(jié)構(gòu)的完整性[15];另一方面增加SOD、POD等活性氧清除酶的活性，清除自由基，減少活性氧的積累，從而降低了低溫脅迫下煙草幼苗葉片膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成量[16，17]。在不同低溫處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因煙草和對照之間各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的差異均達(dá)到極顯著水平。這些結(jié)果與轉(zhuǎn)基因煙草耐寒性的提高相吻合。

在小麥中，Tognetti等[18]研究表明冬小麥中抗寒性強(qiáng)的品種果聚糖含量是抗寒性弱品種的3倍左右，在低溫下，果聚糖更容易合成。Albrecht等[19]對小麥的研究發(fā)現(xiàn)，漬水脅迫持續(xù)6d后，小麥根中果聚糖積累量是對照的18倍。Kawakami等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，抗凍性強(qiáng)的小麥品種積累的果聚糖更多，充分表明果聚糖的累積可以增強(qiáng)小麥的抗寒性。葉興國等[20]研究發(fā)現(xiàn)在水分脅迫處理前15d內(nèi)植物體內(nèi)有較少的果聚糖積累量，水分脅迫21～28d果聚糖積累開始增加，隨著復(fù)水后干旱脅迫解除，果聚糖含量下降。綜上所述，果聚糖在植物體內(nèi)的有效積累可提高小麥的抗旱能力。殷桂香等[21]選用8個小麥基因型進(jìn)行干旱脅迫處理，結(jié)果表明，干早脅迫期間揚(yáng)麥6號葉片中果聚糖含量明顯高于其他基因型葉片中果聚糖含量，其在干旱條件下植株存活率顯著高于其他幾個基因型小麥品種。

本研究結(jié)果表明，HS-6-SFT基因的表達(dá)及果聚糖在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的積累，使轉(zhuǎn)基因植株中可溶性蛋白質(zhì)、SOD和POD含量增加?？扇苄缘鞍踪|(zhì)、SOD、POD是植物細(xì)胞內(nèi)比較重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這些物質(zhì)具有增加細(xì)胞質(zhì)濃度和防止細(xì)胞過度脫水的作用，從而可以減少逆境條件下的氧化脅迫損傷。然而積累果聚糖的轉(zhuǎn)HS-6-SFT基因煙草具體如何調(diào)控植株的生理體制機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

與傳統(tǒng)的雜交育種相比，轉(zhuǎn)基因育種具有育種目的明確和育種年限短等突出優(yōu)點(diǎn)。另一方面，隨著全球氣候的極端變化，對重要糧食作物如小麥、玉米、水稻等作物的生長發(fā)育及其產(chǎn)量形成都造成了嚴(yán)重影響，因而通過分子生物學(xué)途徑導(dǎo)入相關(guān)抗逆基因來改良作物的的抗逆性受到普遍重視。本研究克隆的來源于小麥近緣屬華山新麥草6-SFT基因在煙草中的逆境脅迫耐性研究，證實(shí)6-SFT是一個與植物逆境耐性相關(guān)的基因，可為以后的小麥抗逆育種提供有用的基因資源。

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收稿日期：2019-08-23

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD26B01）;2018年河南省重大科技專項(xiàng)（181100110200）;河南省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系支持項(xiàng)目（Z2010-01-01）;國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系支持項(xiàng)目（CARS-03）

作者簡介：陳真真（1990-），女，河南駐馬店人，助理研究員，碩士，主要從事小麥育種研究，（電話）15225361201（電子信箱）396939159@qq.com。