金沉

摘 要 低氧是實(shí)體瘤的普遍現(xiàn)象，對(duì)腫瘤的增殖、凋亡、血管生成、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、能量代謝及放化療抵抗性都具有重要的作用。本文回顧了兩類針對(duì)低氧腫瘤的藥物研發(fā)策略：作用于低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factors， HIFs）及其相關(guān)信號(hào)通路的分子靶向藥物，以及靶向于腫瘤低氧微環(huán)境的低氧激活前藥，分別列舉了各個(gè)藥物的設(shè)計(jì)思路和作用機(jī)制，對(duì)各種策略所面臨的挑戰(zhàn)與機(jī)遇進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞 低氧 低氧誘導(dǎo)因子 低氧激活前藥

中圖分類號(hào)：R979.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2020）15-0097-05

Hypoxia and antitumor therapy

JIN Chen*

[Xingliu （Shanghai） Pharmaceutical Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China]

ABSTRACT Hypoxia is a common phenomenon of solid tumors and plays an important role in tumor proliferation， angiogenesis， invasion， metastasis， energy metabolism， resistance to chemotherapy and radiotherapy. In this paper， two approaches for targeting hypoxia in cancer therapy are reviewed. One is molecular targeted agents targeting HIFs and relative signal pathway and the other is hypoxia-activated prodrugs targeting tumor hypoxic microenvironment. Several example compounds with their design and mechanism are listed and the particular challenges and opportunities for each strategy are also discussed.

KEY WORDS hypoxia； HIF； hypoxia-activated prodrug

氧氣是影響細(xì)胞生存的重要分子，線粒體在氧氣存在的條件下，通過(guò)呼吸作用產(chǎn)生能量，為細(xì)胞的生存提供能量基礎(chǔ)。2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，授予三位科學(xué)家William G. Kaelin Jr、 Sir Peter J. Ratcliffe和Gregg L. Semenza，以表彰他們?cè)凇凹?xì)胞感知和適應(yīng)氧氣供給機(jī)制”方面的突出貢獻(xiàn)[1]。

早在1955年，Thomlinson Gray觀測(cè)到在距離血管180 mm的腫瘤中心區(qū)域出現(xiàn)壞死的現(xiàn)象，這個(gè)距離剛好超出了血管中氧氣滲透的范圍。研究認(rèn)為，腫瘤不受控制的快速增殖，使中心區(qū)域愈發(fā)遠(yuǎn)離血管，造成氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能輸送到該區(qū)域，因而出現(xiàn)了壞死的現(xiàn)象[2]。這是人類首次對(duì)腫瘤低氧現(xiàn)象進(jìn)行的觀測(cè)與研究。盡管腫瘤具有持續(xù)誘發(fā)促進(jìn)血管生成的能力，但是腫瘤組織中的新生血管形態(tài)異常，微血管網(wǎng)對(duì)于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸相對(duì)低效，高度增殖的腫瘤細(xì)胞的耗氧量，超出了微血管網(wǎng)的供氧量，從而使得遠(yuǎn)離血管的腫瘤中心區(qū)域形成低氧和壞死的現(xiàn)象。越來(lái)越多的研究證明，低氧對(duì)腫瘤的增殖、凋亡、血管生成、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、能量代謝及放化療抵抗性都具有重要的作用[3-8]。

低氧腫瘤的治療策略，目前主要包含兩個(gè)方向：一是作用于HIFs及其相關(guān)信號(hào)通路的分子靶向藥物[9-10]，二是靶向于腫瘤低氧微環(huán)境的低氧激活前藥[11-13]。

1 作用于HIFs及其相關(guān)信號(hào)通路的分子靶向藥物

2019年獲獎(jiǎng)的三位科學(xué)家闡明了細(xì)胞在分子水平上感受氧氣含量的基本原理，揭示了一個(gè)重要的信號(hào)機(jī)制，即低氧誘導(dǎo)因子HIF（hypoxia-inducible factor）。

細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境而產(chǎn)生的生理變化，主要由低氧誘導(dǎo)因子HIF進(jìn)行調(diào)節(jié)。低氧誘導(dǎo)因子能夠調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)，驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境中的適應(yīng)和生存。低氧誘導(dǎo)因子是應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境的轉(zhuǎn)錄因子，是由α亞基（HIF-1α，HIF-2α或HIF-3α）和β亞基（HIF-1β）組成的二聚體蛋白復(fù)合物。HIF-α的蛋白家族中，HIF-1α表達(dá)最為廣泛，對(duì)氧氣敏感；HIF-2α在內(nèi)皮細(xì)胞中首次被檢測(cè)到，只在少量組織中表達(dá)。對(duì)于HIF-3α，目前的研究尚不充分。在氧氣存在的條件下，HIF-1α的脯氨酸殘基經(jīng)過(guò)脯氨酰羥化酶（PHD）的羥基化作用后，被蛋白酶體降解。而在低氧條件下，對(duì)氧氣敏感的脯氨酰羥化酶活性降低，HIF-1α的羥基化過(guò)程不能進(jìn)行，因降解被抑制而累積，進(jìn)而從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與HIF-1β組成HIF二聚體。轉(zhuǎn)錄因子HIF能夠識(shí)別并結(jié)合靶標(biāo)基因的一段堿基序列G/ACGTG，即低氧反應(yīng)元件（hypoxia response elements， HREs），由此開(kāi)啟相關(guān)靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這其中包括影響血管生成、糖脂代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、轉(zhuǎn)移等各方面的調(diào)節(jié)基因[14-15]。

HIF-1α和HIF-2α受到氧氣敏感型脯氨酰羥化酶的調(diào)節(jié)作用，從而引起各種生理功能方面的調(diào)節(jié)，以應(yīng)對(duì)氧氣環(huán)境的變化。HIF-1α在多種腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，被認(rèn)為與低氧有著密切的關(guān)系。靶向于HIF-1α及其下游相關(guān)蛋白，成為低氧腫瘤治療的一個(gè)研究方向。HIF-1α下游相關(guān)蛋白作用機(jī)制明確，如與血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生成因子（VEGF），與代謝相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1（GLUT1），與酸堿平衡相關(guān)的碳酸酐酶Ⅸ（CA Ⅸ），與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的胰島素生長(zhǎng)因子1（IGF1），與轉(zhuǎn)移相關(guān)的賴氨酰氧化酶（LOX），這些都作為分子靶向藥物開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)[16]。

以mTOR（mammalian target of rapamycin）為中心的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞能量代謝的重要通路。作為HIF-1α上游信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，mTOR通過(guò)多種作用途徑，影響和調(diào)節(jié)HIF-1α及其下游基因的表達(dá)。mTOR抑制劑在低氧腫瘤的治療中受到廣泛研究，其中，雷帕霉素類化合物表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果[17-18]。

HIF-1α是受低氧調(diào)節(jié)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，然而，以HIF-1α為直接作用靶點(diǎn)的分子靶向藥物則相對(duì)較少，其原因在于，目前的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-1α的抑制與抗腫瘤活性之間沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)。此外，一些HIF-1α的選擇性抑制劑，也并未表現(xiàn)出其對(duì)低氧腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。HIF-1α的作用機(jī)制與抗腫瘤效果之間的關(guān)系尚未被完全闡明，靶向于HIF-1α的研究策略仍具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。

2 低氧激活前藥

低氧激活前藥，是利用腫瘤低氧這一特殊的環(huán)境，來(lái)設(shè)計(jì)在正常組織中無(wú)活性或活性很低，在低氧環(huán)境中能夠被激活釋放出活性藥物，從而選擇性殺傷低氧腫瘤細(xì)胞。通常，低氧激活前藥是利用低氧腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的還原性酶還原釋放藥物。

腫瘤組織中的還原酶是低氧激活前藥活化的關(guān)鍵因素。還原酶的主要種類有：心肌黃酶（DT-diaphorase）、醌還原酶（quinone reductase）、細(xì)胞色素P450還原酶（cytochrome P450 reductase）、硝基還原酶（nitroreductase）等。大多數(shù)酶對(duì)氧氣敏感，以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）作為氫供體，參與到前藥的還原過(guò)程中。

不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其靶向的還原酶種類各不相同。目前，已經(jīng)證明有四種化學(xué)基團(tuán)能夠在低氧條件下被還原酶降解，它們分別是：過(guò)度金屬絡(luò)合物，醌類化合物，氮氧化合物（脂肪族氮氧化合物、芳香族氮氧化合物），硝基類化合物（硝基苯類化合物、硝基咪唑類化合物）。這四種結(jié)構(gòu)類型為低氧激活前藥的設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[6]。

2.1 過(guò)渡金屬絡(luò)合物

過(guò)度金屬絡(luò)合物是利用不同價(jià)態(tài)的金屬，其絡(luò)合物穩(wěn)定性不同的原理設(shè)計(jì)的。其中，鈷是最為常用的金屬元素（圖1）。三價(jià)鈷的氮芥絡(luò)合物能穩(wěn)定性強(qiáng)，在三價(jià)鈷原子的影響下，氮芥上氮原子的電子云密度降低，細(xì)胞毒性顯著低于氮芥單體。當(dāng)絡(luò)合物進(jìn)入低氧腫瘤組織，在還原酶作用下，三價(jià)鈷原子被還原為二價(jià)鈷原子，導(dǎo)致絡(luò)合物不穩(wěn)定，釋放出細(xì)胞毒藥物氮芥，從而對(duì)低氧腫瘤細(xì)胞造成殺傷[19]。然而，過(guò)渡金屬價(jià)態(tài)之間轉(zhuǎn)化的可逆性仍沒(méi)有解決，該類化合物作為低氧激活前藥的應(yīng)用仍處于探索階段。

2.2 醌類化合物

醌類化合物的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用最早可以追溯到20世紀(jì)60年代絲裂霉素C的發(fā)現(xiàn)。EO9作為絲裂霉素C的衍生物，是目前研究較多的代表性藥物。EO9的作用機(jī)制包括單電子和雙電子的還原過(guò)程，進(jìn)而產(chǎn)生具有DNA損傷性的分子，這一過(guò)程在有氧或低氧的條件下都可以進(jìn)行。雙電子還原酶，包括醌還原酶和心肌黃酶，在藥物降解過(guò)程中起到重要作用，直接決定了藥物是靶向有氧細(xì)胞還是低氧細(xì)胞。所以，只有在含有較少雙電子還原酶的細(xì)胞株上，EO9才是具有選擇性的低氧激活前藥。在缺少雙電子還原酶的條件下，EO9被單電子還原酶還原，如細(xì)胞色素P450還原酶，生成半醌自由基中間體，這一過(guò)程是可逆的。半醌自由基中間體在低氧條件下繼續(xù)被還原，生成具有DNA損傷性的苯二酚類化合物（圖2）。然而，EO9在臨床Ⅰ/Ⅱ期實(shí)驗(yàn)中對(duì)多種腫瘤無(wú)效。研究認(rèn)為是由于藥物無(wú)法有效輸送到腫瘤部位[20]。

2.3 氮氧類化合物

氮氧鍵化合物作為低氧活化基團(tuán)，引起了研究人員的注意。Brown[21]發(fā)現(xiàn)，芳香族氮氧化合物替拉扎明（TPZ）對(duì)低氧腫瘤細(xì)胞有50～200倍的選擇性。這類化合物能夠經(jīng)過(guò)單電子還原生成具有DNA損傷性的自由基。隨后，Wilson[22]發(fā)現(xiàn)脂肪族氮氧化合物也具有類似的性質(zhì)。脂肪族氮氧鍵通過(guò)雙電子還原形成叔胺，該過(guò)程能夠受到氧氣的抑制，因而該過(guò)程對(duì)氧氣敏感，具有低氧選擇性。該類代表化合物有AQ4N。

作為芳香族氮氧化合物的代表，TPZ經(jīng)單電子還原酶（如細(xì)胞色素P450還原酶）的作用，可逆地形成自由基中間體，在低氧的條件下，繼續(xù)還原生成具有DNA損傷性的羥基自由基和苯并三嗪自由基。TPZ也可以被雙電子還原酶（如醌還原酶）還原，但代謝產(chǎn)物不具有細(xì)胞毒性（圖3）。這樣特殊的性質(zhì)使得TPZ在多個(gè)細(xì)胞株上表現(xiàn)出了良好的低氧選擇性。TPZ經(jīng)歷了廣泛的臨床實(shí)驗(yàn)研究，然而，TPZ水溶性差，在體內(nèi)代謝速率快，穿透性差，不能有效達(dá)到低氧區(qū)域，這些缺陷最終限制了其在臨床上的應(yīng)用。

脂肪類氮氧化物AQ4N能夠被雙電子還原酶（如細(xì)胞色素P450同功酶和一氧化氮合成酶）還原，由于氧氣能夠競(jìng)爭(zhēng)性與這兩種酶結(jié)合，對(duì)AQ4N的還原造成抑制，因而AQ4N具有低氧選擇性（圖4）。經(jīng)還原后生成的AQ4對(duì)DNA有著很強(qiáng)的非共價(jià)結(jié)合能力，并且能夠同時(shí)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AQ4N的主要問(wèn)題在于安全性不足。

2.4 硝基苯類化合物

硝基苯類化合物是最早被驗(yàn)證具有低氧選擇性，并應(yīng)用于低氧激活前藥的開(kāi)發(fā)。PR-104是硝基苯類化合物的代表藥物，它是一種水溶性磷酸酯的雙重前藥。PR-104在體內(nèi)能夠迅速水解形成相應(yīng)的醇PR-104A，PR-104A是具有低氧選擇性的化合物，硝基經(jīng)過(guò)單電子或雙電子還原生成羥氨（PR-104H）和胺（PR-104M），而PR-104H和PR-104M能與DNA發(fā)生交聯(lián)作用發(fā)揮細(xì)胞毒性。PR-104A能夠被多種氧化還原酶代謝，在有氧和低氧條件下均能降解（圖5）。PR-104在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明具有顯著的活性，可抑制腫瘤的生長(zhǎng)、減少腫瘤細(xì)胞對(duì)組織的滲透、延長(zhǎng)小鼠的生存期。在肝癌異種移植模型中，PR-104能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并且與索拉非尼的聯(lián)合治療，效果更為顯著。然而，在Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)中，PR-104對(duì)實(shí)體瘤的抑制效果較弱，且有一定的骨髓抑制和中性粒細(xì)胞減少作用[23]。

2.5 硝基咪唑類化合物

硝基咪唑類化合物起初作為放療增敏劑廣泛應(yīng)用于腫瘤放射治療（圖6）。硝基作用機(jī)理與氧氣類似，在硝基自由基的參與下，受電離輻射誘導(dǎo)生成的DNA自由基無(wú)法重新獲得電子進(jìn)行自我修復(fù)，造成不可逆的DNA損傷。受此機(jī)理的啟發(fā)，將硝基類化合物連接上更為有效DNA損傷藥物，成為低氧激活前藥發(fā)展的一個(gè)重要方向。

TH-302是基于2-硝基咪唑的前藥，在低氧條件下被單電子還原酶（如細(xì)胞色素P450還原酶）激活，通過(guò)氨基咪唑的自消除反應(yīng)，發(fā)生分子的裂解，釋放DNA烷化劑溴代異磷酰胺芥（Br-IPM）（圖7）[24]。TH-302對(duì)多種腫瘤細(xì)胞展現(xiàn)出了抗癌活性，尤其是對(duì)存在DNA修復(fù)缺陷的細(xì)胞，如BRCA1，BRCA2或FANCA，在人肺癌H460細(xì)胞株上展現(xiàn)高達(dá)270倍的低氧選擇性。在臨床前研究中對(duì)多種實(shí)體瘤模型有效，包括胰腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、急性骨髓性白血病。

TH-302誘導(dǎo)產(chǎn)生靜息和增殖細(xì)胞中的DNA交聯(lián)，通過(guò)細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。急性骨髓性白血病異種移植模型的體內(nèi)研究表明，TH-302能夠抑制低氧細(xì)胞，延長(zhǎng)生存期，減少白血病干細(xì)胞。小鼠在經(jīng)過(guò)注射TH-302之后，生存期延長(zhǎng)，這表明該方法可能適用于消除化療耐藥性白血病細(xì)胞，證明了通過(guò)低氧激活前藥靶向低氧腫瘤細(xì)胞的可行性。在此基礎(chǔ)上，TH-302進(jìn)行了Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，作為實(shí)體瘤和急性白血病的單一療法。然而，結(jié)果證明其臨床效果有限，只有少數(shù)短暫的積極應(yīng)答。目前，研究人員更多地選擇將低氧激活前藥與普通抗癌藥物聯(lián)合用藥用于腫瘤的治療。

TH-302與常規(guī)抗腫瘤藥物或分子靶向藥物聯(lián)合用藥的治療方法已經(jīng)在多個(gè)臨床前實(shí)體瘤模型和惡性血液腫瘤中應(yīng)用。在不同的腫瘤異種移植模型中，TH-302顯著增加了DNA損傷、凋亡和腫瘤壞死，減少了細(xì)胞內(nèi)缺氧，同時(shí)沒(méi)有增加毒性。在胰腺癌異種移植模型中，TH-302與吉西他濱聯(lián)合用藥顯示了良好的效果；與放射治療聯(lián)合使用，TH-302能夠增強(qiáng)放療的抗腫瘤效果。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和橫紋肌肉瘤異種移植模型中，TH-302與拓?fù)涮婵档穆?lián)合用藥，提高了腫瘤治療效果，延長(zhǎng)了生存期。

然而令人失望的是，2015年12月，TH-302與吉西他濱聯(lián)合用藥用于軟組織瘤和胰腺癌的Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)宣告失敗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藥物無(wú)法長(zhǎng)期有效靶向腫瘤。然而，對(duì)于TH-302的研究并沒(méi)有終止，其它各項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。

3 總結(jié)與展望

靶向低氧相關(guān)信號(hào)通路的研究，如HIF-1a、mTOR，是研究的熱門(mén)方向，并且已有成功上市的藥物。對(duì)于低氧激活前藥的開(kāi)發(fā)，到目前為止，盡管不斷有新的化合物進(jìn)入臨床研究，但是仍沒(méi)有一個(gè)成功的案例。如何解決低氧激活前藥靶向性不足的問(wèn)題，將成為其研究和發(fā)展的關(guān)鍵。本單位利用2-硝基咪唑?yàn)榛罨鶊F(tuán)，以7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿（SN-38）和紫杉醇為藥效基團(tuán)，設(shè)計(jì)與合成了一系列低氧激活前藥，以解決現(xiàn)有低氧激活前藥靶向性不足的問(wèn)題，克服低氧引起的腫瘤耐藥性[25-26]。

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