武小姣，馬錢波，李志威，馬曉宇，趙國琦

（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

甜葉菊（Steva rebaudianaBertoni）是菊科甜葉菊屬多年生草本植物。最初分布于南美洲，如今已栽培分布于亞洲和歐洲[1]。甜葉菊因為富含糖苷，一直是研究的熱點。一方面，其糖苷地一般食用蔗糖甜度的300 倍，另一方面熱量是蔗糖的1/300，因此被譽為繼甘蔗、甜菜之后的第三大糖原[2]。甜菊糖苷還具有藥用價值，能預(yù)防低血糖和癌癥的產(chǎn)生，適合糖尿病、低血糖、高血壓以及肥胖癥患者食用[3]。然而，甜葉菊種子由于其體積小，成熟度不一致，未經(jīng)處理的種子發(fā)芽率很低，一般僅有40%左右。甜葉菊種子價格較貴，目前推廣甜葉菊品種也多為雜種，發(fā)芽率波動較大，產(chǎn)量品質(zhì)參差不齊[4]。

研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑對種子的生產(chǎn)具有調(diào)節(jié)作用。胺鮮酯（DA-6）是一種高能植物生長調(diào)節(jié)劑，能夠有效促進(jìn)藜麥種子萌發(fā)[5]。脫落酸（ABA）能誘導(dǎo)種子休眠[6]，赤霉素（GA3）則能消除脫落酸的作用，并促進(jìn)種子萌發(fā)[7]，適當(dāng)增加乙烯（ETH）也對植物種子萌發(fā)起到促進(jìn)作用[8]。其中對赤霉素的研究較多，湛潤生等發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍的赤霉素浸種可以提高紫花苜蓿（Medicago sativaL.）種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢[9]。李暢等發(fā)現(xiàn)赤霉素也可以提高毛氈杜鵑（Rhododendron confertissimum）種子發(fā)芽率，并且效果顯著[10]。而赤霉素對提高甜葉菊發(fā)芽率的研究未見報道[11-13]。本試驗先用不同濃度赤霉素浸種，根據(jù)電導(dǎo)率確定最佳浸種濃度，測定甜葉菊種子萌發(fā)過程中發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及與其萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的變化，以期確定適宜的赤霉素浸種濃度，對提高甜葉菊種子利用率，為降低種植成本提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的甜葉菊種子購于景云豐種業(yè)公司，在4 ℃種子貯藏柜中保存，發(fā)芽試驗于2019 年12月進(jìn)行。

1.2 試驗方法

試驗根據(jù)高洋等對赤霉素濃度的選擇，確定預(yù)試驗赤霉素濃度為0、50、100、200、400、600 mg·L-1，對相同質(zhì)量甜葉菊種子進(jìn)行浸種處理，以不加赤霉素的甜葉菊種子作為對照，24 h后用雷磁DDBJ-350 型便攜式電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率，根據(jù)電導(dǎo)率的高低確定最佳濃度[14]。

選擇成熟、大小一致的種子，用0.5%的NaClO溶液浸種10 min 消毒后[15]，用超純水漂洗3 次，然后用選定赤霉素濃度浸種1 d，浸種結(jié)束后，用濾紙吸干水分，用鋪有發(fā)芽紙（11 cm×11 cm）的海綿發(fā)芽盒進(jìn)行發(fā)芽試驗，每個發(fā)芽盒100粒種子，放入型號為MGC-450HP-2的人工氣候箱中，培養(yǎng)條件為：光照度3 000 lx，光照16 h，黑暗8 h，溫度25 ℃，濕度70%。每天取足量發(fā)芽過程中的種子，分別包入錫箔紙中，用液氮速冷，放入-80 ℃冰箱保存，連續(xù)收集7 d，統(tǒng)一處理并測定各生理指標(biāo)。

1.3 生理指標(biāo)測定

電導(dǎo)率的測定：預(yù)試驗設(shè)立3個重復(fù)，待浸種結(jié)束，分別測定浸種液的電導(dǎo)率（U1），各空白液的電導(dǎo)率（U2）。按公式計算各浸種處理種子電導(dǎo)率[16]。

可溶性糖的測定：用蒽酮比色法測定可溶性糖，取0.1 g 經(jīng)液氮速凍的樣品，在液氮中研磨成粉，轉(zhuǎn)移至試管中，加入10 mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min，濾出提取液后，再加入10 mL 蒸餾水，重復(fù)提取1 次，提取液合并濾入25 mL 容量瓶中，定容，吸取0.5 mL 樣品提取液，加入1.5 mL 蒸餾水，加入0.5 mL 蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL 濃硫酸，充分震蕩后，將試管放入沸水浴中，保溫1 min，取出后自然冷卻至室溫，于630 nm 波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出可溶性糖含量。

淀粉的測定：采用蒽酮比色法測定淀粉，將提取可溶性糖的殘渣，加20 mL熱蒸餾水，于沸水浴中煮沸15 min，加入9.2 mol·L-1高氯酸2 mL 提取15 min，再以2 500 r·min-1離心10 min，取上清液，于50 mL容量瓶中定容，后續(xù)方法同可溶性糖測定方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出淀粉含量。

可溶性蛋白：采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白，稱取0.1 g冷凍樣品，用組織研磨儀在5 mL蒸餾水中研磨成勻漿，以2 500 r·min-1離心10 min，取1 mL 上清液，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出可溶性蛋白含量。

發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)測定：根據(jù)牧草種子檢驗規(guī)程（GB/T 2930.1～2930.11-2001）進(jìn)行連續(xù)14 d 發(fā)芽情況測定，設(shè)立3個重復(fù)，分別計算發(fā)芽勢（%）、發(fā)芽率（%）、發(fā)霉率（%）。

發(fā)芽勢=n7/M×100%

發(fā)芽率=n14/M×100%

發(fā)霉率=n'/M×100%

公式中n7，n14分別為發(fā)芽前7 d 和發(fā)芽第14天的發(fā)芽種子數(shù)，n'為到第14天發(fā)霉種子數(shù)，M為供試種子總數(shù)（100粒）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2007 進(jìn)行統(tǒng)計處理和制圖，采用SPSS 22.0 進(jìn)行方差分析，用Duncan's 進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素最佳濃度的確定

電導(dǎo)率之所以可以成為選擇赤霉素濃度的依據(jù)，是因為種子細(xì)胞膜破損時，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)會滲出，其中電解質(zhì)會提高浸種液的電導(dǎo)率[12]。一定濃度的赤霉素對種子細(xì)胞膜具有修復(fù)作用，從而降低浸種液的電導(dǎo)率。

隨著赤霉素濃度的增加，甜葉菊種子浸出液（U2）的電導(dǎo)率先降低后升高，在赤霉素濃度為200 mg·L-1時浸種的電導(dǎo)率顯著低于其他各濃度（P<0.05），由浸種液和空白（U1）的差值（U2～U1），表明赤霉素對甜葉菊種子細(xì)胞膜的確具有修復(fù)作用，但是隨著赤霉素濃度升高逐漸變成抑制作用，在400 mg·L-1之后開始抑制，綜合效果與經(jīng)濟(jì)性考慮選擇赤霉素濃度200 mg·L-1作為最佳濃度（見圖1）。

圖1 不同濃度赤霉素浸種處理對甜葉菊種子電導(dǎo)率的影響

2.2 赤霉素浸種對甜葉菊種子萌發(fā)的影響

通過測定200 mg·L-1GA3浸種后的發(fā)芽情況，甜葉菊的發(fā)芽率與發(fā)芽勢高于清水浸種，種子的發(fā)霉情況好于清水浸種（見表1）。從前7 d 的發(fā)芽情況可以看出赤霉素能顯著提高甜葉菊種子的發(fā)芽速率（P<0.05），并且在第5天趨于平穩(wěn)，而清水浸種組在第4天發(fā)芽趨于平穩(wěn)，并且發(fā)芽能力低于赤霉素處理組（見圖2）。

表1 赤霉素浸種對甜葉菊種子萌發(fā)的影響%

圖2 甜葉菊種子在不同處理下前7天的發(fā)芽動態(tài)

2.3 赤霉素浸種對甜葉菊種子萌發(fā)過程中可溶性糖的影響

清水浸種時可溶性糖呈逐漸下降趨勢，在測定時間內(nèi)，第6天達(dá)到最小值6.49 mg·g-1，而赤霉素浸種時可溶性糖的變化與清水處理有所不同，呈先降后升趨勢，在第5 天達(dá)最小值9.25 mg·g-1，并且顯著高于清水處理組（P<0.05）（見表2）。

2.4 赤霉素浸種對甜葉菊種子萌發(fā)過程中淀粉含量的影響

清水處理和赤霉素處理時淀粉含量的變化表現(xiàn)出一致性。兩者都隨時間變化呈顯著降低的趨勢，并且最后均趨于平緩（P<0.05）。但兩者在第0天表現(xiàn)出差異，清水處理組淀粉含量0.55 mg·g-1高于赤霉素處理組0.48 mg·g-1（見表3）。

2.5 赤霉素浸種對甜葉菊種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白的影響

清水處理組可溶性蛋白變化呈顯著下降趨勢（P<0.05），并且在第5 天趨于平穩(wěn)，但是赤霉素處理組整體呈現(xiàn)前期高，后期低的變化特點，在第0 天雖含量（0.07 mg·g-1）低于清水處理組（0.15 mg·g-1），但最終含量略高于清水處理組（見表4）。

表2 赤霉素浸種對甜葉菊種子萌發(fā)過程中可溶性糖的影響

表3 赤霉素浸種對甜葉菊種子萌發(fā)過程中淀粉含量的影響

表4 赤霉素浸種對甜葉菊種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白的影響

3 討 論

發(fā)芽率和發(fā)芽勢作為種子最基本的生長指標(biāo)能最直觀表現(xiàn)植物發(fā)芽階段生長好壞。赤霉素作為植物生長調(diào)節(jié)劑具有打破休眠功能，探索不同濃度和浸種時間下赤霉素對植物的作用效果。嚴(yán)澤埔等研究發(fā)現(xiàn)對薄殼核桃幼苗（Carya illinoensisi）葉面噴施100 mg·L-1赤霉素，能促進(jìn)薄殼山核桃莖桿伸長[17]。而鄒竣竹在浸種處理野牛草（Buchloe dactyloides）時，GA3濃度高達(dá)2 000 mg·L-1，也起到顯著破除休眠作用[18]?？梢姺N子的大小與結(jié)構(gòu)差異，對赤霉素濃度的選擇有很大影響，而甜葉菊種子由于體小不適合長時間和高濃度浸種，因此浸種濃度在選擇上存在差異。劉曉敏等以山桐子（Ide?sia polycarpaMaxim.）作為材料時確定200 mg·L-1GA3浸種1 d 為最佳方案，與本文探究結(jié)果一致[19]。邱鵬飛等對沙冬青（Ammopiptanthus mongolicusMax?im.）種子萌發(fā)的研究中也得到了相似的結(jié)論。而本研究也發(fā)現(xiàn)赤霉素處理組種子發(fā)霉率較低，在前人的研究中未見報道，可能與赤霉素能提高抗逆性有關(guān)[20]。

由于種子萌發(fā)初始主要依靠自身貯藏物質(zhì)，而可溶性糖作為植物體中最活躍的成分，在萌發(fā)中過程被分解。清水處理組可溶性糖含量隨著時間逐漸降低，并無波動。這與陶貴榮等對柴胡（Bu?pleurm chineseDC.）種子萌發(fā)中的研究一致[21]。然而赤霉素處理組在浸種后測定可溶性糖含量低于清水處理組，這可能是由于赤霉素浸種期間種子內(nèi)外滲透勢的差異，引起部分可溶性糖組分參與浸種液的滲透調(diào)節(jié)，同時滿足種子生長需要而轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)有關(guān)。樊雨在研究赤霉素對高山杜鵑（Rhododen?dron delavayi）開花生理的影響中得到類似結(jié)論[22]。測定期間可溶性糖含量出現(xiàn)波動，可能與可溶性糖的高度活躍有關(guān)，這與淀粉酶的活化與合成有密切聯(lián)系，赤霉素浸種后可溶性糖始終保持較高的含量，更加有利于甜葉菊種子的萌發(fā)。

淀粉幾乎存在于所有植物種子中，一方面作貯藏物質(zhì)，另一方面在淀粉酶的作用下可以很快轉(zhuǎn)化為短鏈糖，從而對可溶性糖產(chǎn)生影響。通過對淀粉含量的測定，可以從一定程度上表現(xiàn)淀粉酶的活性。赤霉素浸種和清水浸種的差異主要出現(xiàn)在一開始，并且前者低于后者，這可能與赤霉素對淀粉酶的調(diào)控有關(guān)，赤霉素浸種提高了淀粉酶含量，從而促進(jìn)了淀粉的分解。胡曉倩等在研究小麥（Triti?cum aestivumL.）種子時得出了類似的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)赤霉素能夠提高淀粉酶的活力，從而對種子萌發(fā)起到了積極的作用[23]。

可溶性蛋白是種子內(nèi)重要的貯藏物質(zhì)，一方面參與新蛋白質(zhì)合成，一方面通過滲透調(diào)節(jié)抵御脅迫。測定初始兩種處理可溶性蛋白含量均不高，可能與種子吸水時，貯藏蛋白外滲有關(guān)，與陳麗培對油松（Pinus tabuliformisCarr.）種子的研究一致[24]，但試驗發(fā)現(xiàn)赤霉素組低于清水組，可能與清水組的脅迫高于赤霉素組有關(guān)，也可能與赤霉素對蛋白的調(diào)控有關(guān)[25]，由此可以看出赤霉素也能改善甜葉菊種子的生長條件。

4 結(jié) 論

從發(fā)芽情況、貯藏物質(zhì)變化、滲透物質(zhì)變化綜合來看，甜葉菊種子在200 mg·L-1GA3下浸種24 h后的萌發(fā)生長能起到積極的作用。