莫勝蘭 張步嫻 甘海霞 尹彥文 施開創(chuàng) 屈素潔 粟艷瓊 鄒聯(lián)斌 韓銀華

（廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心，南寧530001）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種RNA病毒，由其引起的雞新城疫是我國雞業(yè)最重要的疫病之一，該病發(fā)病急，致死率高，如防控不當會引起很大的經(jīng)濟損失[1，2]。東興市地處中越邊境，邊境貿(mào)易頻繁，活禽市場交易的家禽來源復雜，家禽和市場環(huán)境帶毒情況不明，因此對活禽市場進行新城疫等重大動物疫病的監(jiān)測，及時掌握新城疫疫情動態(tài)，可以有效提高廣西邊境地區(qū)家禽重大動物疫情的預測、預警、預報能力，進一步扎實推進基層動物疫病防控工作的開展，確保轄區(qū)內(nèi)不發(fā)生新城疫疫情。為做好新城疫流行病學調(diào)查工作，以系統(tǒng)評估新城疫的流行狀況及控制措施效果，本研究于2015-2017年對廣西東興市某活禽市場進行了系統(tǒng)監(jiān)測，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設備雞胚自動孵化器由上海智誠公司生產(chǎn)；高速離心機由德國艾本德公司生產(chǎn)，自動化核酸提取儀由Tiangen公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀器由美國ABI公司生產(chǎn)，生物安全柜由美國BAKER公司生產(chǎn)。

1.1.2 試劑NDV陽性血清和抗原，新城疫病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒，可從青島立見科技有限公司購買;磁珠法DNA/RNA提取試劑盒可從北京Tiangen公司獲得；SPF雞胚（主要雞傳染病病原的雞群）可從北京梅里亞公司購買。

1.1.3 樣品采集2015-2017年對東興市某活禽市場每年按季度進行樣品采集，共采集到各種棉拭子樣品1482份，其中雞咽喉/肛門棉拭子樣品540份，鴨咽喉/肛門棉拭子樣品754份，環(huán)境（包含有飲水、籠具表面、地面糞便、排水溝污水）拭子188份，樣品的詳細信息見表1。采集的棉拭子保存在裝有1mL保存液的2mL離心管中，在24h內(nèi)若能及時檢測的樣品可以置于4℃冰箱短暫保存，否則樣品應冷凍保存或運輸。

保存液配方如下：將甘油200mL、0.01M PBS（pH值7.2）800mL和3g頭 孢 西 丁 鈉 混 勻 獲 得1000mL樣品保存液。

表1 東興市某活禽市場2015-2017年新城疫病毒流行狀況調(diào)查樣品采集信息

1.2 病原分離和鑒定

1.2.1 病原分離將采集的棉拭子樣品以10000 r/min離心5min，每份樣品取上清液0.2mL，通過尿囊腔接種11日齡SPF雞胚，放到雞胚自動孵化器37℃孵育4d，觀察頻率為2次/d，丟棄1d內(nèi)死亡的雞胚，1d后死亡的雞胚及時收集，至4d后將所有雞胚置于冰箱冷藏層過夜，然后在生物安全柜中用注射器收集雞胚尿囊液。

1.2.2 血凝試驗根據(jù)國家標準《GB/T 16550-2008新城疫診斷技術(shù)》對收集的雞胚尿囊液用血凝試驗測定其血凝效價。

1.2.3 病毒鑒定病毒鑒定按照以下步驟進行：

第一步，待檢樣品總RNA提取：在核酸提取板的第一列和第七列分別加入200μL的上清液樣品和20μL蛋白酶K，放到自動化核酸提取儀進行核酸提取。核酸自動提取按以下程序進行:移磁珠1min，吸磁60s→90℃裂解15 min，吸磁90s→85℃洗滌2min,吸磁90s→85℃洗滌,吸磁30s→85℃洗脫5min,吸磁90s→棄磁珠。結(jié)束程序后，將總RNA轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。

第二步，實時熒光RT-PCR檢測:取出熒光RTPCR反應液、酶混合液，在室溫融化后，瞬間離心，依照每份RT-PCR反應液17μL、酶混合液3μL的比例預混兩種反應液到熒光專用反應管中；分別向加有反應液的PCR管中加入5μL樣本RNA或陰性對照或陽性對照，混勻，將其放入熒光定量PCR儀器中，按以下步驟進行反應：第一階段42℃5min，95℃10s；第二階段95℃5s，60℃35s，共反應40個循環(huán)。在第二階段的每個循環(huán)60℃退火過程中收集熒光。當樣本的CT值小于35.0時，判斷為陽性。

1.3 統(tǒng)計分析方法

用Excel軟件對病毒陽性率分別按照樣品采集時間和樣品來源等進行分類統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 按時間分類的檢測結(jié)果

對2015-2017年采集的1482份樣品進行雞胚接種收集尿囊液后用熒光RT-PCR方法對尿囊液進行檢測，共檢測到36份新城疫病毒陽性樣品（見表2），樣品的總陽性率為2.43%，2015年樣本的陽性率最高達6.06%，2016年和2017年的陽性率相差不大，分別為0.74%和0.83%，遠遠低于2015年的陽性率。

表2 東興市某活禽市場NDV檢測結(jié)果（按年份）

表3 東興市某活禽市場NDV檢測結(jié)果（按樣品來源）

2.2 按樣品來源分類的檢測結(jié)果

從不同來源的樣品中均能分離到新城疫病毒，雞、鴨和環(huán)境樣品在2015年的陽性率均為最高，2016年和2017年陽性率差別不大。其中環(huán)境樣品的陽性率最高，總陽性率達5.85%，而在2015年的陽性率高達18.97%，2016年和2017年卻未分離到病毒；雞拭子的總陽性率為2.78%，2015年的陽性率為5.88%，2016年和2017年的陽性率分別為1.25%和1.43%；鴨拭子的陽性率最低，總陽性率僅為1.33%，2015年的陽性率2.99%，2016年和2017年的陽性率分別為0.67%和0.45%，見表3。表明新城疫病毒在東興某活禽市場的環(huán)境和家禽中均有存在，家禽樣品的陽性率與環(huán)境樣品陽性率密切相關(guān)，環(huán)境的帶毒率越高，家禽的陽性率就越高。

3 討論

本研究對東興某活禽市場新城疫病毒流行狀況進行了持續(xù)3年的監(jiān)測，結(jié)果顯示，該市場上采集的樣本新城疫病毒總體陽性率為2.43%，這個結(jié)果與段博芳等在云南的監(jiān)測結(jié)果基本符合[3]。新城疫病毒在東興某活禽市場的分布與樣品來源密切相關(guān)，其中雞的感染率高于鴨子[4]，環(huán)境中帶毒量最高。從不同年份監(jiān)測的結(jié)果看，2015年該市場的新城疫病毒陽性率最高，而2016年和2017年的陽性率則大幅降低，可能的原因是2016年和2017年由于受H7N9的影響，該市場管理單位加強了對市場的清洗和消毒，新城疫病毒存活的環(huán)境被破壞了，使得環(huán)境中的新城疫病毒的帶毒量顯著降低，從而降低了家禽感染新城疫的風險。

近年來，隨著我國全面清除新城疫的防治戰(zhàn)略的深入，以及養(yǎng)雞業(yè)的不斷發(fā)展，新城疫的高發(fā)病勢頭得到了一定程度的控制，總體呈下降趨勢[5]。我國家禽新城疫流行逐年減少的原因可能與我國目前新城疫的綜合防控措施有關(guān)。首先，疫苗接種在新城疫的預防和控制中起著重要作用。家禽從業(yè)人員普遍認識到新城疫對家禽養(yǎng)殖業(yè)的危害很大，實施免疫的積極性和主動性較好。其次，近年來新城疫疫苗質(zhì)量不斷提高，新城疫疫苗配送所需的基層冷鏈體系效果顯著，新城疫預防工作更加扎實。最后，目前我國家禽養(yǎng)殖方式由農(nóng)戶散養(yǎng)向規(guī)模養(yǎng)殖轉(zhuǎn)變，生物安全管理水平越來越高，降低了新城疫發(fā)生風險。本研究較為系統(tǒng)和科學地對廣西東興市某活禽市場新城疫病毒流行狀況進行了持續(xù)監(jiān)測，揭示了新城疫病毒在活禽市場的環(huán)境中和家禽中在不同年份分布的一些規(guī)律，可為預防和控制NDV提供一些重要的流行病學信息。