趙湖冰,黎 華,田 野,于志海,劉曉輝,黃名正,劉曉柱

(貴州理工學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550000)

果酒是指鮮果經(jīng)破碎、發(fā)酵而成的一種低酒精度飲品。除原料、工藝、設(shè)備等因素外,微生物在果酒釀造中扮演著至關(guān)重要的角色。果酒發(fā)酵中起主要作用的是釀酒酵母,其發(fā)酵活性強(qiáng),酒精代謝旺盛。但非釀酒酵母菌作為果酒發(fā)酵過程中非接種發(fā)酵菌群,卻對(duì)果酒風(fēng)味及成分有著顯著影響,其代謝及發(fā)酵作用在很大程度上影響果酒的復(fù)雜性[1-2]。在模擬葡萄汁中接種3株非釀酒酵母中,共檢測(cè)出74種與酵母代謝相關(guān)的揮發(fā)性化合物,其中葡萄汁有孢漢遜酵母產(chǎn)生香氣物質(zhì)較為豐富,典型發(fā)酵香氣包括乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、乙酸-2-苯乙酯、辛酸和香茅醇,賦予了葡萄酒復(fù)雜的果香和花香[3]。目前對(duì)非釀酒酵母的認(rèn)識(shí)主要停留在葡萄酒等傳統(tǒng)釀造領(lǐng)域,在其它果酒釀造中的了解還十分有限。

刺梨(Rosaroxburghii)薔薇科、薔薇屬,多年生落葉叢生灌木植物,其果實(shí)中VC含量高達(dá)2200～2500 mg/100 g,是獼猴桃的10倍,故有“VC之王”美稱。此外,刺梨果實(shí)中還富含多種維生素、多糖、胡蘿卜素、黃酮類、三萜及苷類、過氧化物歧化酶等具有生物活性物質(zhì),是一種較好的果酒釀造源水果[4-5]。刺梨作為貴州省重點(diǎn)發(fā)展的特色產(chǎn)業(yè)之一,2018年全省種植面積達(dá)219.65萬(wàn)畝,生產(chǎn)總值達(dá)31.61億元[6]。盡管刺梨具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,但刺梨果實(shí)中含有較多的單寧,鮮果生食口感較差[7],因此,對(duì)刺梨進(jìn)行深加工是刺梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然選擇。利用刺梨鮮果發(fā)酵生產(chǎn)刺梨果酒是一種比較可行的刺梨加工方式。但目前,還缺乏刺梨果酒專用酵母。利用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵果汁,包括共接種和順序接種兩種方式,可有效提高增加發(fā)酵果酒中香氣物質(zhì)成份或含量。但目前還未見有刺梨非釀酒酵母的報(bào)道。因此,本研究采用傳統(tǒng)的微生物分離技術(shù),從貴州刺梨鮮果上選育出一株產(chǎn)香濃郁的非釀酒酵母,分析了其生理特性,并與商業(yè)酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵,探討其對(duì)刺梨果酒風(fēng)味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨為貴農(nóng)5號(hào) 采自貴州龍里地區(qū);商業(yè)化釀酒酵母ZYMAFLORE X16(簡(jiǎn)稱X16) 法國(guó)LAFFORT公司;賴氨酸固體培養(yǎng)基 海博生物技術(shù)有限公司;對(duì)硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D glucopyranoside,p-NPG) 上海源葉生物科技有限公司;蔗糖 本地超市;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純 購(gòu)自貴州博奧瑞杰生物科技有限公司。

雷磁PHSJ-3F pH儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UH5300紫外分光光度計(jì) 日本日立公司;CKX41-倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司;SZM體視顯微鏡 中國(guó)寧波舜禹儀器有限公司;電子舌味覺系統(tǒng) 日本Insent公司;Bio-rad T100TM PCR儀、GelDocXR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)伯樂公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 YPD培養(yǎng)基:稱取酵母浸粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,加熱煮沸溶解于蒸餾水中,定容至1000 mL,pH自然。固體培養(yǎng)基另加入20 g瓊脂,滅菌備用。使用時(shí)加入氯霉素100 mg/L。

WL培養(yǎng)基:稱取酵母浸粉4 g、蛋白胨5 g、葡萄糖50 g、瓊脂20 g,量取儲(chǔ)存液A 40 mL(磷酸二氫鉀13.75 g/L,氯化鉀10.625 g/L,氯化鈣3.125 g/L,七水合硫酸鎂3.125 g/L),儲(chǔ)存液B 1 mL(氯化鐵2.5 g/L,硫酸錳2.5 g/L),儲(chǔ)存液C 1 mL(0.44 g溴甲酚綠溶于10 mL無(wú)菌蒸餾水和10 mL 95%乙醇中),加熱煮沸溶解于蒸餾水中,定容至1000 mL,pH自然。

賴氨酸培養(yǎng)基:稱取賴氨酸培養(yǎng)基粉末66.3 g,量取8.4 mL 60%乳酸鉀溶液,加熱煮沸溶解于蒸餾水中,定容至1000 mL,冷卻至50 ℃左右時(shí),用16%乳酸溶液調(diào)整pH至4.8±0.2,混勻,傾入無(wú)菌平板中,備用。

亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基[8]:稱取檸檬酸鉍銨5 g、亞硫酸鈉3 g、甘氨酸10 g、葡萄糖10 g、酵母浸粉1 g、瓊脂15 g、加熱溶解于1000 mL蒸餾水中,煮沸1 min,調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2。

1.2.2 菌株分離與鑒定 參考徐亞男[9]、蔣文鴻[10]方法,稱取100 g新鮮成熟刺梨在無(wú)菌研缽中輕輕搗碎,放入無(wú)菌250 mL錐形瓶中,密封置于28 ℃進(jìn)行自然發(fā)酵,分別于發(fā)酵第1、3、5 d取樣。采用梯度稀釋法并涂布于YPD固體平板上,28 ℃培養(yǎng)48 h。然后挑取單克隆,繼續(xù)劃線于YPD固體平板上,直至為純的單克隆為止。

YPD固體平板上純的單克隆菌株劃線于賴氨酸培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察其生長(zhǎng)情況,在賴氨酸培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)的為非釀酒酵母。選YPD固體平板上純的單克隆菌株劃線于WL固體培養(yǎng)基上28 ℃,培養(yǎng)5 d,觀察菌落顏色和形態(tài),以鑒定非釀酒酵母的類別。挑取YPD固體平板上純的單克隆菌株,置于顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生殖方式。

PCR擴(kuò)增菌體26S rDNA D1/D2區(qū)域,進(jìn)行分子鑒定。PCR反應(yīng)體系包括Taq PCR Master Mix(2×)25 μL,引物NL1和NL4(10 μmol/L)各2 μL,菌液2 μL,反應(yīng)體積為50 μL。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源序列搜索比對(duì),采用MEGA X 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 菌株以106CFU/mL接種于YPD液體培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng),每隔4 h取樣,以YPD液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌懸液OD值,平行重復(fù)3次,共取樣40 h。根據(jù)時(shí)間和OD600值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 菌株生理特性分析 以X16作為對(duì)照,培養(yǎng)菌株F16、X16并調(diào)整濃度至106CFU/mL。分別將F13、X16接種至不同處理組的YPD液體培養(yǎng)基中,糖處理組葡萄糖質(zhì)量濃度為100、150、200、250、300 g/L,乙醇處理組乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%、6%、9%、12%、15%,酸處理組檸檬酸酸度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,SO2處理組SO2質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、300 mg/L,單寧處理組為單寧濃度0、5、10、15、20、25 g/L,各處理組分別于28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)34 h,在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌懸液OD值,平行重復(fù)3次,以測(cè)定菌體對(duì)葡糖糖、乙醇、檸檬酸、SO2以及單寧的耐受性[11-12]。

1.2.5 硫化氫產(chǎn)生能力分析 參考王優(yōu)蓓等[13]研究方法,用鑷子夾取滅菌濾紙片貼于事先準(zhǔn)備好的亞硫酸鉍培養(yǎng)基表面,吸取10 μL濃度為106CFU/mL的菌液滴加在濾紙片上,待液體完全吸入培養(yǎng)基后,28 ℃倒置培養(yǎng)5 d,觀察培養(yǎng)基變色情況。產(chǎn)H2S能力由高到低顯色情況分別為顯棕黑色、棕色、墨綠色、淡墨綠色及不顯色。

1.2.6 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力分析 采用對(duì)硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷(p-NPG)法分析菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力。參照侯曉瑞等[14]文獻(xiàn)方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為y=0.1302x+0.0226,R2=0.9995。

菌株以106CFU/mL接種于YPD培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h,取1 mL發(fā)酵液于離心管中,4 ℃、8000 r/min,離心10 min,取上清液作為粗酶液。取0.1 mL粗酶液與0.2 mL 35 mmol/L p-NPG混勻,40 ℃保溫30 min,加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng),于400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。酶活力單位(U)定義為pH5.0、50 ℃條件下,1 min水解p-NPG產(chǎn)生1 μmol p-NP所需酶量。

1.2.7 菌株混合發(fā)酵 將新鮮刺梨榨汁,調(diào)整其pH為3.5,糖度為24 °Bx。將非釀酒酵母F13和釀酒酵母X16種子液以1∶1比例混合接種于刺梨汁中,使其菌株終濃度為108CFU/mL。25 ℃恒溫靜置發(fā)酵,以糖度不再降低,酒精度不再增加判定發(fā)酵終點(diǎn)。以X16單獨(dú)發(fā)酵作為對(duì)照,每個(gè)樣本3個(gè)平行重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后,取刺梨果酒4 ℃、3000 r/min離心5 min去殘?jiān)?上清液用于后續(xù)分析[15-16]。

1.2.7.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、總酸、揮發(fā)酸、pH測(cè)定 參照GB/T 15038-2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17],進(jìn)行刺梨果酒乙醇體積分?jǐn)?shù),總酸和揮發(fā)酸的測(cè)定。刺梨果酒pH測(cè)定采用pH儀進(jìn)行。

1.2.7.2 總糖測(cè)定 采用李曉旭等[18]優(yōu)化蒽酮法測(cè)定刺梨果酒總糖。采用乙酸乙酯配制15 mg/mL蒽酮溶液,0.2 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,稀釋至2 mL,蒽酮試劑0.5 mL,冷水浴中加入濃硫酸5 mL,搖勻。迅速放入水浴鍋中,80 ℃下水浴15 min,取出后流動(dòng)水冷卻至室溫,在620 nm處測(cè)定其吸光度。以糖含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為y=13.90x+0.038,R2=0.999。

采用GB/T 15038-2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法》酸水解刺梨果酒,測(cè)定的值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為樣品中葡萄糖值。

1.2.7.3 電子舌分析刺梨果酒感官特性 取刺梨酒樣上清液80 mL倒入電子舌專用燒杯中進(jìn)行檢測(cè),試驗(yàn)采用清洗溶液和刺梨果酒樣本交替檢測(cè)序列進(jìn)行檢測(cè),清洗溶液為專用電極清洗液。采樣時(shí)間120 s,采樣速度為1次/s,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,每個(gè)平行重復(fù)采集4次[19]。

1.2.7.4 HS-SPME-GC-MS分析刺梨果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì) 借鑒李雪等[20]研究方法,取8 mL刺梨果酒,加入2.0 g NaCl,40 ℃水浴萃取刺梨果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)。萃取頭插入進(jìn)樣口中,180 ℃進(jìn)行解吸附2 min。GC-MS分析條件為:PEG.20 m彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),1 mL/min流量的氦氣為載氣。進(jìn)樣口溫度50 ℃,出樣口溫度235 ℃。離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度為150 ℃,調(diào)諧EMV 947 V,質(zhì)量掃描范圍為30.00～500.00 amu。NIST 14.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索并匹配GC-MS采集得到的數(shù)據(jù),進(jìn)行定性分析。采用峰面積歸一化法進(jìn)行物質(zhì)的定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,Excel 2007進(jìn)行作圖。SPSS 17進(jìn)行數(shù)據(jù)差異分析。兩組均數(shù)間比較用成組t檢驗(yàn),多組均數(shù)間比較用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 非釀酒酵母的篩選與鑒定

賴氨酸培養(yǎng)基鑒定結(jié)果表明,刺梨自然發(fā)酵液中共分離得到80株非釀酒酵母。形態(tài)分析結(jié)果與測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),分離到的刺梨非釀酒酵母包括葡萄汁漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)、伯頓絲孢畢赤酵母(Hyphopichiaburtonii)、克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)、Pichiasporocuriosa、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)五類。通過嗅聞法初篩后獲得7株非釀酒酵母菌,進(jìn)一步接入刺梨汁發(fā)酵后篩選出1株果香和酒香味較濃的酵母菌株,編號(hào)為F13,對(duì)該菌株進(jìn)行了深入分析。

F13菌株顯微形態(tài)為檸檬狀,出芽繁殖(圖1A);YPD培養(yǎng)基上菌落黃白色、有光澤、邊緣整齊、凸起、表面濕潤(rùn)(圖1B)。F13在賴氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,說(shuō)明F13是一株非釀酒酵母(圖1C)。F13在WL培養(yǎng)基上,菌落深綠色、邊緣平整、光滑濕潤(rùn)(圖1D)。因此,根據(jù)F13顯微形態(tài)與菌落形態(tài),初步認(rèn)為F13為一株漢遜酵母(Hanseniasporasp.)。

圖1 菌株F13細(xì)胞與菌落形態(tài)Fig.1 Cellular and colonial morphologies of the F13 strain注:A:菌株F13細(xì)胞顯微鏡形態(tài)(×400,bar=100 μm);B:菌株F13在YPD培養(yǎng)基菌落形態(tài);C:菌株F13在賴氨酸培養(yǎng)基菌落形態(tài);D:菌株F13在WL培養(yǎng)基菌落形態(tài)。

采用PCR方法擴(kuò)增F13菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BLAST結(jié)果表明,菌株F13與Hanseniasporauvarum菌株同源性較高,達(dá)97%相似性。因此,認(rèn)為F13為1株來(lái)源于刺梨的葡萄汁有孢漢遜酵母,其進(jìn)化樹結(jié)果見圖2。

圖2 基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列構(gòu)建的酵母菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence

2.2 非釀酒酵母F13生長(zhǎng)曲線

非釀酒酵母菌株F13生長(zhǎng)曲線如圖3所示,前4 h為延滯期,4～16 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,16 h后達(dá)到穩(wěn)定期。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期F13生長(zhǎng)速率小于商業(yè)化的釀酒酵母X16,且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間比X16長(zhǎng);穩(wěn)定期階段F13與X16生長(zhǎng)特性較為一致。

圖3 非釀酒酵母F13生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of non-Saccharomyces cerevisiae F13 strain

2.3 非釀酒酵母F13生理特性分析

葡萄糖耐受性結(jié)果如圖4A所示,菌株F13與商業(yè)化釀酒酵母X16在100～300 g/L葡萄糖濃度范圍內(nèi),均可生長(zhǎng)。但各濃度葡萄糖處理下,F13菌體濃度均顯著低于X16。

圖4 非釀酒酵母F13耐受性分析Fig.4 Tolerance of non-Saccharomyces cerevisiae F13 strain注:A:葡萄糖耐受性;B:檸檬酸耐受性;C:乙醇耐受性;D:二氧化硫耐受性;E:單寧耐受性;與X16組相比,*代表差異顯著,P<0.05。

酸耐受性結(jié)果如圖4B所示,菌株F13在酸度1.0%～3.0%范圍不受影響,均可生長(zhǎng),其生長(zhǎng)量與商業(yè)化釀酒酵母X16相比無(wú)顯著差異,表明非釀酒酵母F13菌株具有較強(qiáng)的酸耐受性。

乙醇耐受性如圖4C所示,F13酒精耐受性隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而逐漸降低,在乙醇體積分?jǐn)?shù)6%時(shí)生長(zhǎng)受到明顯抑制。與商業(yè)化釀酒酵母X16相比,F13乙醇耐受性顯著降低。

SO2耐受性結(jié)果如圖4D所示,F13菌株生長(zhǎng)量在SO2質(zhì)量濃度50～300 mg/L范圍內(nèi)均可生長(zhǎng),波動(dòng)較小,表明F13可耐受300 mg/L SO2。此外,F13在SO2不同濃度下,其生長(zhǎng)量與釀酒酵母X16之間無(wú)顯著區(qū)別。

單寧為多酚類高度聚合化合物,可與蛋白質(zhì)和消化酶形成難溶于水復(fù)合物,具有抗菌抑菌作用。刺梨中含有大量單寧,含量一般在0.6%～2.2%之間[21]。F13單寧耐受性如圖4E所示,F13菌株生長(zhǎng)量在單寧濃度0～25 g/L范圍內(nèi)均可生長(zhǎng),波動(dòng)不大,表明,F13可耐受25 g/L 的單寧。此外,F13在單寧不同濃度下,其生長(zhǎng)量與釀酒酵母X16之間無(wú)顯著區(qū)別。

2.4 硫化氫產(chǎn)生能力

在酒類釀造中,酵母菌通過自溶,蛋白質(zhì)分解可產(chǎn)生H2S。H2S具有大蒜味或臭雞蛋味,少量存在即可對(duì)酒體風(fēng)味帶來(lái)不良影響。此外,H2S還能與醇類物質(zhì)反應(yīng)生成有害健康的低級(jí)硫醇。如圖5所示,F13在亞硫酸鉍瓊脂平板上濾紙片為無(wú)色,即不產(chǎn)生硫化氫。商業(yè)化釀酒酵母X16平板上濾紙片為棕色,說(shuō)明具有較強(qiáng)的H2S產(chǎn)生能力。因此,非釀酒酵母F13產(chǎn)H2S產(chǎn)生能力小于X16。王汝瑱[22]對(duì)從寧夏賀蘭山東麓三個(gè)酒莊分離得到的菌株產(chǎn)H2S產(chǎn)生能力進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母都具有較強(qiáng)的H2S產(chǎn)生能力,而分離得到的非釀酒酵母葡萄汁有孢漢遜酵母不產(chǎn)H2S,與本研究結(jié)果一致。

圖5 亞硫酸鉍瓊脂平板法分析非釀酒酵母F13硫化氫產(chǎn)生能力Fig.5 Analysis of hydrogen sulfide production ability of non-Saccharomyces cerevisiae F13 strain by barium sulfite agar plate method注:A:F13;B:X16。

2.5 β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生能力

以對(duì)硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo),400 nm波長(zhǎng)下的吸光值為縱坐標(biāo),繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=0.1302x+0.0226,R2=0.9995,吸光值與對(duì)硝基苯酚濃度之間為線性關(guān)系。菌株F13產(chǎn)β-葡萄糖苷酶結(jié)果如表1所示,β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生能力較低。商業(yè)釀酒酵母X16產(chǎn)β-葡萄糖苷酶量約為F13產(chǎn)酶量的2倍。

表1 p-NPG顯色法產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力測(cè)定Table 1 Determination of β-glucosidase production by p-NPG chromogenic method

圖6 對(duì)硝基苯酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.6 Standard curve of p-nitrophenol solution

2.6 非釀酒酵母F13對(duì)刺梨果酒品質(zhì)的影響

2.6.1 非釀酒酵母F13對(duì)刺梨果酒常規(guī)理化指標(biāo)的影響 利用非釀酒酵母F13與商業(yè)化釀酒酵母X16混合發(fā)酵刺梨,以X16純種發(fā)酵為對(duì)照,分析F13對(duì)刺梨果酒品質(zhì)的影響。刺梨果酒基本理化指標(biāo)如表2所示,F13混合發(fā)酵刺梨果酒的pH、總酸與X16純種發(fā)酵刺梨果酒相比,無(wú)顯著區(qū)別;F13混合發(fā)酵刺梨果酒的總糖高于X16純種發(fā)酵刺梨果酒,酒精度、揮發(fā)酸則低于X16純種發(fā)酵刺梨果酒。表明,F13混合發(fā)酵顯著影響刺梨果酒的殘?zhí)橇?、酒精度和揮發(fā)酸含量。

表2 刺梨果酒的理化指標(biāo)Table 2 Physical and chemical indicators of Rosa roxburghii wine

由表2可知,F13與X16混釀刺梨果酒降酸能力大于純種X16,因此刺梨果酒釀造中加入非釀酒酵母F13具有一定降酸效果。Bely等[23]采用德爾布有孢酵母與釀酒酵母混釀時(shí),葡萄酒中揮發(fā)酸含量減少53%;Kapsopoulou等[24]采用耐熱克魯維酵母和釀酒酵母混釀是也可實(shí)現(xiàn)生物降酸作用,與本研究結(jié)果一致。

2.6.2 非釀酒酵母F13對(duì)刺梨果酒感官品評(píng)的影響 采用電子舌分析了非釀酒酵母F13對(duì)刺梨果酒感官品評(píng)的影響,結(jié)果如圖7所示,采用非釀酒酵母F13與釀酒酵母X16混合發(fā)酵刺梨果酒與釀酒酵母X16純種發(fā)酵刺梨果酒,在咸味、酸味、苦味、澀味、鮮味、豐富度、后味A、后味B響應(yīng)值上均無(wú)顯著差異,表明非釀酒酵母F13與釀酒酵母X16混釀與純種釀酒酵母X16釀造刺梨果酒相比,在感官品評(píng)方面無(wú)顯著影響。

圖7 刺梨果酒滋味屬性雷達(dá)圖Fig.7 Taste attribute radar chart of Rosa roxburghii wine

2.6.3 非釀酒酵母F13對(duì)刺梨果酒香氣物質(zhì)的影響 利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)測(cè)定非釀酒酵母F13與釀酒酵母X16混合發(fā)酵刺梨果酒(F13+X16)揮發(fā)性香氣物質(zhì)成分。如圖8所示,F13混合發(fā)酵刺梨果酒中共檢出41種香氣物質(zhì),包括醇類12種、酯類15種、醛酮類3種、其他類11種;釀酒酵母X16純種發(fā)酵刺梨果酒檢中檢測(cè)出41種香氣成分,其中醇類11種、酯類17種、醛酮類3種、其他類10種。F13+X16混合發(fā)酵比X16純種發(fā)酵減少了酯類物質(zhì)的種類,增加了醇類和其它類物質(zhì)的種類。F13+X16混合發(fā)酵酯類物質(zhì)總量較X16組相比也發(fā)生顯著性降低,但醇類物質(zhì)總量顯著性增加,醛酮類類物質(zhì)和其它種類物質(zhì)總量變化不顯著。

圖8 刺梨果酒香氣物質(zhì)種類及含量Fig.8 The aroma substances and their contents in Rosa roxburghii fruit wine注:與X16組相比,*代表差異顯著,P<0.05。

2種刺梨發(fā)酵果酒中主要的酯類物質(zhì)均為辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯和2-糠酸乙酯,其在F13+X16發(fā)酵刺梨果酒酯類物質(zhì)比例分別為45.3%、19.7%、13.7%、6.6%和3.8%。庚酸甲酯為F13+X16發(fā)酵刺梨果酒中所特有香氣物質(zhì),異丁酸乙酯、己酸甲酯、十一酸甲酯為X16純種發(fā)酵刺梨果酒中所特有物質(zhì);2種刺梨發(fā)酵果酒中主要的醇類物質(zhì)均為苯乙醇、正己醇和正辛醇,其在F13+X16發(fā)酵刺梨果酒醇類物質(zhì)中比例分別為73.2%、5.1%、4.4%。

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)刺梨自然發(fā)酵果汁中的非釀酒酵母進(jìn)行了分離和鑒定,賴氨酸培養(yǎng)基共鑒定出80株非釀酒酵母,鑒定出包括Hanseniasporauvarum、Hyphopichiaburtonii、Pichiakluyveri、Pichiasporocuriosa、Wickerhamomycesanomalus五大類。通過嗅聞法從中篩選出一株產(chǎn)香較為濃郁的F13菌株做深入分析,形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)果表明該菌株屬于Hanseniasporauvarum。生理特性進(jìn)一步研究表明,該菌株具有高耐糖、高耐酸、高耐SO2、高耐單寧、不產(chǎn)H2S等優(yōu)點(diǎn),具有一定的商業(yè)開發(fā)潛力。但與商業(yè)化的釀酒酵母相比,其酒精耐受性,產(chǎn)β-葡萄糖苷酶量等方面還稍遜一籌;同時(shí)在菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期前,其生長(zhǎng)速率還低于商業(yè)化釀酒酵母。所以,還需要采用傳統(tǒng)育種技術(shù)或現(xiàn)代化的基因工程育種方式,對(duì)該菌株進(jìn)行改造,使其具有更好、更優(yōu)的生理特性。

共接種F13菌株與釀酒酵母X16菌株進(jìn)行混合發(fā)酵刺梨果酒,果酒中的乙醇體積分?jǐn)?shù)、總酸和揮發(fā)酸等指標(biāo)均低于釀酒酵母純種發(fā)酵刺梨果酒;而殘?zhí)橇扛哂卺劸平湍竂16純種發(fā)酵刺梨果酒。盡管F13菌株混合發(fā)酵對(duì)刺梨果酒的感官評(píng)價(jià)未產(chǎn)生影響,但增加了刺梨果酒醇類物質(zhì)的種類和含量,如具有玫瑰香特性的苯乙醇在F13混合發(fā)酵果酒中含量高于X16單一菌種發(fā)酵果酒。此外,非釀酒酵母通過可分泌多種胞外酶,分解果汁中香氣前體物質(zhì),有助于豐富果酒中香氣物質(zhì)的種類和含量,本研究?jī)H測(cè)定了該菌株β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生能力,測(cè)定酶的種類有限,其蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶等其它酶類還需要做進(jìn)一步的研究,以進(jìn)一步分析該菌株的產(chǎn)酶特性。

綜上,本研究首次報(bào)道了從貴農(nóng)5號(hào)刺梨果實(shí)中分離與鑒定非釀酒酵母,并進(jìn)行了混合發(fā)酵刺梨果酒研究,該研究為進(jìn)一步提升刺梨果酒品質(zhì)奠定了基礎(chǔ),在后期的研究中,將擴(kuò)大菌株的研究種類,為刺梨釀造篩選更多優(yōu)質(zhì)本土酵母,同時(shí)也將進(jìn)一步進(jìn)行放大生產(chǎn),進(jìn)行中試化試驗(yàn)。