葉會科，王秋珍，何耀東，汪光義

（1 天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津300072；2 天津大學青島海洋技術研究院，山東青島266200；3 河北農業(yè)大學海洋學院，河北秦皇島066000）

二十二碳六烯酸（DHA）是目前發(fā)現(xiàn)的碳鏈最長的ω-3 多不飽和脂肪酸，具有抗心腦血管疾病、抗血脂、降血壓、預防各種癌癥等功效，參與炎癥反應、血液凝結等重要的生理過程，同時在嬰幼兒視網膜形成、神經發(fā)育、智力發(fā)育等方面起著關鍵作用[1-2]。深海魚油是DHA 的傳統(tǒng)來源，但其存在成本高、重金屬污染等缺點[3]。同時，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)深海魚類等高等生物并不能直接合成DHA，而是通過外界攝取來獲取DHA[4]。因此，越來越多的研究人員將研究方向聚焦于海洋食物鏈的初級生產者——海洋藻類和海洋微生物上。海洋微生物由于具有生長周期短、不受季節(jié)限制等優(yōu)勢，成為DHA 等多不飽和脂肪酸的重要來源[5]。能夠生產DHA的海洋微生物主要是一些低等的海洋真菌、微藻和原生生物等，其中破囊壺菌由于具有生長速度快、油脂含量高、易于培養(yǎng)等諸多優(yōu)勢，成為目前工業(yè)化生產DHA 的理想物種之一[6]。

1 破囊壺菌概述

破囊壺菌（thraustochytrids）是一類分布于海水、半咸水、腐爛紅樹葉及藻類等特定環(huán)境中的類真菌類原生生物[7]。大多數(shù)破囊壺菌在腐爛的植物和藻類的殘渣上進行腐生，少數(shù)寄生于海洋無脊椎動物[8]。早在1934年就已經有科學家分離出了破囊壺菌，因其可產生雙鞭毛的浮游孢子，破囊壺菌在發(fā)現(xiàn)的初期 被 分 類 為 真 菌 界（Eumycetes）、 卵 菌 綱（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）[9-10]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，相關學者發(fā)現(xiàn)破囊壺菌并不屬于真菌，在進化距離上與盤根足蟲更為相近。因此，破囊壺菌最終被列為生物界（stramenopila）、不等毛門（heterokonta）、網黏菌綱（labyrinthulomycetes）、破囊壺菌目（thraustochytriales）、破囊壺菌科（thraustochytriaceae）[11-12]。根據最新的分子分類學研究， 破囊壺菌共包括9 個屬， 分別為Aurantiochytrium、Thraustochytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、Sicyoidochytrium、Japonochytrium、Ulkenia 和Schizochytrium、Monorhizochytrium[13]。本實驗室在我國的諸多海域均使用松花粉垂釣法分離出了多株破囊壺菌，并對相關海域的可培養(yǎng)破囊壺菌多樣性進行了分析，揭示了破囊壺菌的高產油特性，是發(fā)酵生產脂肪酸的潛力菌[14]。

破囊壺菌細胞所含油脂中的脂肪酸成分簡單，主要是棕櫚酸（C16∶0）和DHA[14]，已被證實為理想的DHA 工業(yè)化生產菌，表1 對現(xiàn)階段研究較多的可用于生產DHA 的破囊壺菌菌株進行了總結。早 在2003 年Bailey 等[16]在14000 加侖（1 加 侖=3.7854118L） 的發(fā)酵罐中使用Schizochytriumsp.ATCC20888，獲得了171.5g/L的生物量，且其DHA產量可達35.33g/L，2004年美國的Martek公司就已經將破囊壺菌中的Schizochytruimsp.進行商業(yè)化利用來發(fā)酵生產DHA[23]；國內相關學者于2013 年，在7000L 的發(fā)酵罐中使用Schizochytriumsp.CCTCC M209059 可獲得生物量128.3g/L，DHA 產量達39.2g/L[15]。破囊壺菌油脂中的飽和脂肪酸棕櫚酸可作為生物柴油的主要原料，因而使其成為極具研究價值的能源微生物[24]。此外，破囊壺菌細胞內含有的其他活性成分，如類胡蘿卜素、角鯊烯等萜類物質[7,25]對人體健康有著至關重要的作用。破囊壺菌具有較高的營養(yǎng)價值，目前已被證明可用于海參等諸多海產生物幼體的培育。使用添加破囊壺菌菌體的飼料，不僅可以降低幼體的發(fā)病率，提高免疫力和成活率，還能使其體重和肉質中的DHA 比例增加，從而提升產品品質和市場價值[26-27]。因此，開發(fā)破囊壺菌高附加值代謝產物的工業(yè)化生產技術具有極高的經濟價值。

表1 現(xiàn)階段研究較多生產DHA的破囊壺菌菌株匯總

2 破囊壺菌DHA合成路徑

目前破囊壺菌生物合成DHA 的代謝途徑并不明確，一般認為破囊壺菌可以通過兩種途徑合成DHA，即傳統(tǒng)的脂肪酸合成酶（fatty acid synthesis pathway，F(xiàn)AS）和聚酮合酶（polyketide synthesis pathway，PKS）[28-29]。本文作者課題組在最近的研究中通過轉錄組分析了Thraustochytriidaesp.PKU#Mn16利用葡萄糖或甘油兩種單一碳源以及兩種混合碳源的DHA 合成通路，結果發(fā)現(xiàn)與利用葡萄糖為碳源時相比，當利用混合碳源時其FAS通路相應基因有所上調；而與甘油為碳源相比，當利用混合碳源時，其PKS 路徑上的相應基因有所上調，這表明兩個DHA合成路徑同時存在于破囊壺菌中，且與外界營養(yǎng)條件有密切關系[20]。在合成脂肪酸的過程中，兩條途徑均以乙酰CoA和丙二酸單酰CoA為基本合成單位，同時碳鏈延伸的共價結合位點也一致，但兩者所涉及的關鍵酶不同。此外，與FAS途徑相比，PKS途徑具有以下兩個特點：①不飽和脂肪酸直接由乙酰輔酶A合成，并不是首先合成飽和脂肪酸再由去飽和酶形成雙鍵；②在整個合成路徑中并不需要氧氣的參與，但在有氧條件下PKS途徑依然可以運行，只是氧分子不參與反應[30]。

2.1 脂肪酸合成酶（FAS）途徑

傳統(tǒng)的脂肪酸合成酶（fatty acid synthesis pathway，F(xiàn)AS）途徑主要通過碳鏈的延伸和去飽和作用而合成DHA。其中FAS 是一個多酶復合體，包括酰基轉移酶、烯酰ACP 還原酶、脫水酶、酮酰ACP 還原酶、酮酰ACP 合成酶、磷酸泛巰基乙胺轉移酶和?；d體蛋白ACP，以及其他的一些輔酶[23]。破囊壺菌通過FAS 途徑合成DHA 的過程如圖1所示。

圖1 破囊壺菌合成多不飽和脂肪酸的FAS通路

破囊壺菌發(fā)酵生產DHA 較常用的碳源是葡萄糖和甘油，而這兩種碳源必須經過糖酵解途徑代謝為丙酮酸，再由丙酮酸氧化為乙酰輔酶A才能夠進入脂肪酸合成途徑。在微生物體內，葡萄糖首先經過糖酵解途徑（EMP）或磷酸戊糖途徑（HMP）被代謝為丙酮酸。甘油進入微生物體內后首先在甘油激酶（GK）的催化下磷酸化為3-磷酸甘油，再通過線粒體內膜上的FAD+依賴型的3-磷酸甘油脫氫酶（FAD+-G-3-PDH）轉化為磷酸二羥丙酮，隨后進入EMP 途徑[31]。其中，HMP 途徑不直接為生物體提供能量，但是能夠為脂肪酸代謝提供一系列的前體物質（NADPH、核酸等）。在有氧條件下，丙酮酸在線粒體中被完全氧化為乙酰輔酶A。脂肪酸合成的前體物質是乙酰輔酶A，微生物可利用體內的乙酰輔酶A在FAS的作用下通過一系列的生物化學反應合成軟脂酸（16∶0）[32]。這一系列的反應包括乙?；D移反應、丙二酰轉移反應、脫水反應、縮合反應以及還原反應。而軟脂酸可以在碳鏈延長酶的作用下生成硬脂酸（C18∶0），隨后在△9 去飽和酶的作用下生成油酸（OA，18∶1）、△9和△12 去飽和酶的作用下生成亞油酸（LA，18∶2）、△9、△12和△15去飽和酶作用下生成亞麻酸（ALA，18∶3）[33]。亞油酸（LA，18∶2）和亞麻酸（ALA，18∶3）分別進入n-6和n-3脂肪酸合成途徑，隨后在△6、△5和△4去飽和酶以及延長酶的交替作用下分別生成DHA（二十二碳六烯酸）和DPA（二十二碳五烯酸）[34]。目前，在整個合成路徑中，△4-去飽和酶[35]、△5-延長酶[36]、△12-去飽和酶[37]和△5-去飽和酶[38]已經被克隆并鑒定，其他去飽和酶和延長酶尚未被鑒定。

Hauvermale 等[39]從S.sp.ATCC20888 的 基 因 組DNA中分離出3個編碼多不飽和脂肪酸合成酶亞基的基因，并在大腸桿菌中進行了表達，在得到的轉化子中積累了DHA和DPA，且DHA/DPA的比值與裂殖壺菌中的比值大致相同；Metz 等[40]對S. sp.ATCC20888 的FAS 合成酶基因定點突變后，發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌只能合成飽和脂肪酸，而無法合成DHA。這些研究表明在破囊壺菌體內存在FAS路徑的相關基因，一旦相關基因被干擾，其DHA 合成就會受到影響。對該途徑中的關鍵酶進行進一步的研究，更有利于對破囊壺菌生產DHA進行代謝調控。

2.2 聚酮合酶（PKS）途徑

有研究發(fā)現(xiàn)破囊壺菌科中的裂殖壺菌不能將外源14C 標記的C22∶5 轉化成DHA，因此，推測破囊壺菌的合成途徑可能不只有FAS途徑[41]。將裂殖壺菌與可產生多不飽和脂肪酸的海洋希瓦氏細菌的基因進行比較，發(fā)現(xiàn)其基因中存在編碼PKS 的結構域，進而提出裂殖壺菌合成DHA 的途徑類似于海洋細菌中的PKS途徑，稱為聚酮合酶途徑[42]。破囊壺菌通過PKS途徑合成DHA的過程如圖2所示。

PKS途徑中并沒有去飽和酶和延長酶，是由乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A提供碳原子，先轉化為含有?；d體蛋白質（ACP）的酯類，并在縮合酶的作用下生成3-酮丁酰中間物。隨后在酮乙基還原酶、脫水酶和烯酰還原酶的作用下轉化為丁酰-ACP。最后，丙二酰輔酶A 再次按上述方式連接到脂肪酰鏈上，每次增加2個碳原子，逐漸延長碳鏈。PKS途徑是由一個類似聚酮合成酶的基因簇控制，它包括β-酮酰合成酶、β-酮酰-ACP 還原酶、烯酰還原酶、脫水酶/異構酶、?；D移酶和?；d體蛋白。在上述一系列酶的催化下，乙酰輔酶A 和丙二酸單酰輔酶A 作為基本單位，經過縮合、還原、脫水、還原/異構的循環(huán)合成DHA[34]。在破囊壺菌Thraustochytrid aureumATCC 34304 突變株中，F(xiàn)AS 途徑被阻斷，但其DHA 產量仍高于野生株[37]，由此表明PKS路徑的存在。

Li 等[43]從Schizochytriumsp.ATCC MYA1381 的PKS 基因簇中克隆了鏈長因子（CLF）和脫氫酶（DH），并通過同源重組將其打亂導致PUFAs 生物合成顯著下降，其中CLF 的破壞降低了C22 PUFA的比例，而DH 的破壞則降低了各PUFA 的產量。李清[44]對Schizochytrium limacinumOUC168 的pks1（3908bp）和pks2（4272bp）基因成功克隆，其結果顯示pks1 可能屬于脫水/異構酶（DH），pks2 可能包含兩個Ketoacyl-synthase 超家族，分別為Acyl transferase 超家族和TIM_phosphatebinding 超家族；周兵兵[45]通過對該菌株中的pks1基因過表達，將菌體的生物量和DHA 產量分別提高了14.6% 和37.9%。婁菲等[46]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中，當溫度降低時，Schizochytriumsp.S31 中PKS 相關基因（PFA1、PFA2 和PFA3）的表達量均有所上調，增加了PUFA 的含量。Ren 等[47]通過實驗證明PKS 系統(tǒng)中的?；D移酶（AT） 基因的缺失導致了Schizochytriumsp. HX-308 的DHA 在總 脂 肪酸中的比例下降，而重組AT基因的導入使得DHA比例有所提高；此外，Ren 等[48]利用RNA-seq 技術對S.sp. HX-308 不同發(fā)酵階段的差異基因進行了比較，發(fā)現(xiàn)PKS 途徑中的基因pfaC 對環(huán)境變化表現(xiàn)出較高的敏感性，可能是未來促進多不飽和脂肪酸生物合成的關鍵調控因子。綜上所述，在破囊壺菌合成DHA 中，PKS 系統(tǒng)占有很重要的地位，提高PKS相關基因的表達量能夠提高其DHA產量。

圖2 破囊壺菌合成DHA的PKS通路

目前對于不同屬的破囊壺菌合成DHA 的具體機制尚未明確，對部分酶功能的認識尚處于推測階段，并沒有進行功能驗證和實驗結果的支持。此外，對兩條途徑之間的關系也并未研究清楚，兩條途徑之間是分工明確還是協(xié)調統(tǒng)一的關系尚待探究。以上一系列關于DHA 合成途徑的問題迫切需要進行深入研究，以豐富對脂肪酸合成路徑的認識，為破囊壺菌發(fā)酵生產DHA 的代謝調控提供理論基礎。

3 影響破囊壺菌合成DHA的因素

微生物生產高附加值代謝產物不僅受到自身遺傳因素的影響，而且與外部營養(yǎng)和環(huán)境條件息息相關[49]。同樣，破囊壺菌DHA 的發(fā)酵生產也受許多環(huán)境因子的影響，包括碳氮源、溫度、溶解氧、pH、鹽度等。只有選擇最為合適的培養(yǎng)條件，才更有利于DHA 的工業(yè)化發(fā)酵生產，因此發(fā)酵條件的優(yōu)化成為發(fā)酵生產中必不可少的一個環(huán)節(jié)[50]。表2總結了不同破囊壺菌菌株在搖瓶培養(yǎng)條件下生產DHA 的最佳碳氮源條件。下文對影響破囊壺菌DHA 累積的3 個關鍵因素（碳氮源、溫度和溶解氧）進行綜述。

3.1 碳、氮源

微生物細胞結構的基本單位是碳架。碳、氮源是微生物生長、增殖和代謝的基本原料。破囊壺菌屬于異養(yǎng)型原生生物，在其發(fā)酵過程中必須添加適量的碳源和氮源，才能有足夠的物質和能量維持自身的繁殖和代謝。碳、氮源的種類和濃度，對破囊壺菌的生長繁殖速度、脂質累積速度和DHA 合成速度均有很重要的影響。

破囊壺菌常用的碳源包括葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和可溶性淀粉等[59]。不同菌株的最適宜的碳源種類不同，本文作者課題組之前對兩株破囊壺菌T.sp.PKU#Mn16和Schizochytrium.sp.PKU#Mn4 進行最優(yōu)碳源的考察，發(fā)現(xiàn)使用不同碳源培養(yǎng)，生物量的差異并不明顯，但其油脂和DHA產量卻具有顯著影響，其中甘油是最有利于油脂和DHA積累的碳源。與葡萄糖相比，在甘油為碳源的條件下兩株菌的DHA占總油脂的比例分別增加了16.2%和12.77%[21]。同樣地，在甘油為碳源的條件下，Schizochytrium limacinumSR21的DHA相對含量（DHA占總脂肪酸的比例）高達72.6%，遠遠超過了以葡萄糖為碳源的比例（30%～48%），由此表明甘油更有利于破囊壺菌中DHA的積累[18]。裂殖壺菌S.sp.S31和Thraustochytrium roseumMF2以葡萄糖為碳源時，生物量、脂質含量以及DHA 產量均較高；而以乳糖、蔗糖等為碳源時，生物量和DHA產量均遠低于前者[53-54]。因此，碳源對破囊壺菌的生長、脂肪酸和DHA 累積均有明顯影響。葡萄糖和甘油是破囊壺菌可利用的優(yōu)質碳源，同時與葡萄糖相比甘油更有利于破囊壺菌油脂的積累，而葡萄糖則對生物量的貢獻更大。

表2 破囊壺菌在搖瓶發(fā)酵的最佳碳氮源培養(yǎng)條件、生物量和DHA產量

破囊壺菌常用的氮源包括酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、谷氨酸鈉、玉米漿、尿素等有機氮源以及硫酸銨、乙酸銨、硝酸銨等無機氮源。不同氮源對不同破囊壺菌菌株的生長和油脂積累的影響具有很大差異。在無機氮源硝酸鈉條件下，裂殖壺菌S.sp.S31 的生物量達到最大值（7.46g/L）；當以尿素為氮源時，其油脂占生物量的比例達到最大值（43.39%）；以硝酸鈉作氮源，其油脂積累量達到最大值（2.4g/L）；使用酵母粉作氮源則可獲得最高 的 DHA 產 量 （0.31g/L）[54]。 破 囊 壺 菌Thraustochytriumsp. T01 利用酵母粉和蛋白胨作為混合氮源時，可以獲得較高的生物量（27g/L），與無機氮源（尿素、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉和硝酸鉀）相比其生物量為原來的4～7倍[57]。吳克剛等[53]對T.roseumMF2生產DHA的氮源利用進行了考察，結果發(fā)現(xiàn)其最優(yōu)氮源為谷氨酸鈉；氮源種類對其生物量、脂質含量以及DHA 產量均有明顯影響，但是對DHA 相對含量并沒有顯著性影響，基本在60%左右。本文作者課題組[21]在前期對破囊壺菌T.sp.PKU#Mn16和S.sp.PKU#Mn4研究中發(fā)現(xiàn)，使用酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨和谷氨酸鈉等有機氮源，其細胞生長以及油脂積累均優(yōu)于無機氮源條件；在酵母粉條件下，DHA 產量最高分別達到1.16g/L 和0.82g/L。因此，不同的氮源種類對破囊壺菌的生長影響不盡相同；與無機氮源相比，有機氮源尤其是酵母粉等，更有利于破囊壺菌的生長和DHA累積。

針對碳氮源的研究，除了選擇適當?shù)奶嫉捶N類外，碳氮源的濃度以及合適的碳氮比（C/N）也是影響破囊壺菌細胞生長和代謝的重要因素[60]。在較低濃度范圍內，隨著碳源濃度的升高，破囊壺菌的生長速度加快；當碳源濃度增加到一定量時，其生長速度會減緩甚至生長受到抑制。氮源濃度的升高能夠促進菌體的生長，但不利于油脂以及DHA的積累，培養(yǎng)基中碳源主要用于細胞生長；當培養(yǎng)基中氮源消耗至一定量時，細胞開始使用培養(yǎng)基中的碳源進行油脂積累[49,61]。當分別以葡萄糖和谷氨酸鈉為碳源和氮源（碳氮比為70）時，T. roseumMF2 的DHA 積 累 量 達 到 最 高1.242g/L。 對Aurantiochytriumsp. T66 進行限氮培養(yǎng)后，其細胞中DHA 含量提升了一倍左右[62]。高碳氮比有利于破囊壺菌油脂積累量增大，在實際生產中，應適當提高培養(yǎng)基中的碳氮比，使破囊壺菌生產DHA 達到最優(yōu)的條件。

總之，不同破囊壺菌菌株對碳源和氮源的選擇性不同，因此在實際操作中應當針對不同菌株使用不同的培養(yǎng)基成分及配比。葡萄糖和甘油是最常用的碳源，但是兩者對生物量和油脂的貢獻則各有不同，氮源促進細胞分裂，但是在氮源存在的前提下其油脂積累較少，因此在后續(xù)發(fā)酵中可考慮使用混合碳源進行發(fā)酵，并適當提高碳氮比以提升DHA的產量。同時，在生產中應適當考慮實際效益情況，盡量選擇來源廣、易獲取、價格低的原料進行生產，盡量降低生產成本，以獲得最大的經濟效益。

3.2 溶解氧

破囊壺菌作為一類異養(yǎng)需氧微生物，主要通過有氧呼吸，將營養(yǎng)物質氧化成二氧化碳和水，并合成大量的能量來維持細胞的生命活動。整個過程是經過氧化呼吸鏈才能得以實現(xiàn)，同時氧氣是呼吸鏈的終端電子受體，因此發(fā)酵液中必須有適當濃度的溶解氧才能維持菌體的正常生理過程[63]。

關于破囊壺菌合成DHA 的途徑一般認為有兩條：一是需氧的傳統(tǒng)脂肪酸合成途徑（FAS），另一條是不依賴于氧的聚酮合酶途徑（PKS）[23]，下文會詳細介紹兩條DHA合成途徑。在FAS路徑中，破囊壺菌合成DHA 需氧參與碳鏈的延長以及去飽和的過程，溶解氧的多少能夠直接影響菌體內DHA 的累積。而在PKS 路徑中，雖然DHA 由聚酮合酶催化、乙酰輔酶A 作為碳鏈骨架而最終合成，不需要氧氣的參與；但是溶解氧影響著菌體的整個生命過程，如不提供氧氣，菌體的生長便會受到抑制，繼而影響DHA 的產量[42]。由于破囊壺菌體內FAS與PKS兩條通路同時存在，而溶解氧對兩條通路均有影響，因此溶解氧作為一個非常重要的發(fā)酵參數(shù)受到廣泛關注。

一般在實際生產過程中，采用兩階段培養(yǎng)法，在高溶氧條件下使菌體大量增殖，然后降低溶氧促進DHA 的積累。對S.sp.HX-308 進行兩階段培養(yǎng)，通過改變發(fā)酵罐攪拌轉速或通氣量以降低溶氧水平，其油脂和DHA 積累量分別提升了43.83%和63.88%[64]。而對于S.limacinumSR21，在高溶氧條件下，細胞大量增殖，但細胞大小和質量變化不明顯；在低溶氧條件下，細胞體積變大，油脂積累；對其進行分階段溶氧控制培養(yǎng)，使得生物量與對照組提高了54%左右，最高可達37.9g/L，而DHA 產量也達到6.56g/L[65]。因此，在今后的破囊壺菌發(fā)酵生產中，應根據破囊壺菌的不同生長階段改變其供氧量，最終達到高產DHA的目的。

3.3 溫度

溫度對微生物的生長和油脂累積具有重要影響[66]。嗜熱微生物菌體所包含不飽和脂肪酸的量極少，而嗜冷微生物菌體內則含有較多的不飽和脂肪酸[67]。一般而言，在一定溫度范圍內，菌體生物量隨溫度升高而增加并達到峰值；但其油脂中不飽和脂肪酸的比例則隨溫度升高而降低，其可能是低溫能夠激活趨飽和酶基因的表達，菌體通過增加細胞膜中不飽和脂肪酸的含量來提高其流動性，以此抵抗外界低溫環(huán)境的影響[68]。

不同的破囊壺菌菌株的生長和代謝的最適溫度有所差異。通常情況下，破囊壺菌的最適生長溫度為15～35℃，在最適溫度范圍內其生物量能夠達到最高值，但其油脂以及DHA的積累量不一定達到最大；低溫脅迫可以提高DHA 的產量[69]。在25℃時，S. limacinumSR21 生物量達到最大值（42.45g/L）；當溫度降低至20℃時，其多不飽和脂肪酸含量有所增加，DHA占總油脂比例由34%提高到了37.05%，而DHA 產量也由8.4g/L 提高到了9.8g/L[70]；裂殖壺菌S.sp.HX-308在30℃培養(yǎng)32h后，降低其培養(yǎng)溫度對其進行溫度脅迫，最終DHA 占總油脂的比例可達51.98%，與之前相比提高了42%[71]。因此，在破囊壺菌工業(yè)化生產DHA 中應考慮采取兩步發(fā)酵法，首先在較適宜的發(fā)酵溫度下獲得充足的生物量，再對其進行低溫脅迫以增加DHA 含量，最終達到DHA高產的目的。

綜合上述影響因子，將破囊壺菌生產DHA 的整個過程分為兩個階段：第一階段是菌體生長時期，在這個時期內細胞密度快速增加，而細胞內DHA 積累較少；第二階段是DHA 合成階段，在這個階段菌體細胞數(shù)量變化不大，然而細胞內的DHA大量積累[15]。通常情況下，在第一階段，菌體細胞生長需要大量的營養(yǎng)物質以及初級代謝產物，因此需要較高濃度的碳源和氮源、較適宜的生長溫度以及較高的溶氧條件。而在氮源消耗至較低濃度時，菌體開始積累DHA 等次級代謝產物，在這個階段應考慮補加碳源，促進次級代謝產物的合成[72]。如表3所示為分階段培養(yǎng)法在破囊壺菌發(fā)酵生產DHA 中的應用，可以明顯看出與單一條件培養(yǎng)相比，在分階段培養(yǎng)條件下其DHA 產量有大幅度提升。因此，在實際的工業(yè)發(fā)酵過程中應在發(fā)酵的初始階段一次性補加足夠的氮源，添加最適破囊壺菌菌體生長的碳源，適當提高溫度以及供氧量來促進菌體的快速增長；至氮源消耗盡時，進入第二階段，此時補加碳源，降低溫度以及供氧量進行限氮、低氧、低溫脅迫，促進菌體中DHA 的合成以達到高產的目的。

4 破囊壺菌發(fā)酵生產DHA 的中試研究

微生物發(fā)酵中試試驗是在實驗室小規(guī)模實驗的基礎上，模擬工業(yè)化條件所進行的工藝研究，其目的是驗證放大后小試工藝的可行性，以及菌株是否具有可放大、可工業(yè)化生產的潛力，從而為正式生產提供數(shù)據。中試放大是微生物發(fā)酵實驗到產品生產不可或缺的一個環(huán)節(jié)，有利于降低產業(yè)化的風險，同時也能夠在一定程度上使研發(fā)、生產成本有所降低[77]。利用破囊壺菌發(fā)酵生產DHA 的中試研究目前尚處于起步階段，由于在放大過程中不可能保持所有物理或化學參數(shù)不變，因此必須對影響中試發(fā)酵的關鍵因素進行研究，進而更好地為產業(yè)化服務。

對于對剪切力不敏感的微生物而言，在好氧發(fā)酵過程中，體積傳氧系數(shù)（KLa）通常是最重要的影響因素，因此KLa是好氧發(fā)酵中最常見的中試放大準則之一[78]。以KLa為放大準則是通過在不同規(guī)模的發(fā)酵罐中保持KLa、攪拌功率、幾何形狀、容積功率輸入等相關變量的相似性，逐步擴大到較大的發(fā)酵罐中，進而擴大其培養(yǎng)規(guī)模[77]。Qu等[79]基于KLa成功地將S.sp. CCTCC M209059 發(fā)酵規(guī)模擴大至7000L，最終，其DCW 產量達到92.7g/L，DHA濃度達17.7g/L。在以KLa為準則進行放大時，同樣應考慮到發(fā)酵液流體力學、機械剪切力等相關的作用。Zhao等[80]研究了15L發(fā)酵罐中不同的葉輪結構對S.sp.HX-308 發(fā)酵過程中細胞生長以及DHA 合成的影響，發(fā)現(xiàn)不同類型葉輪組合能夠顯著提高裂殖壺菌生物量及DHA產量，生物量最高可達108g/L，DHA 產量最高可達21.42g/L，占總油脂的48.17%。Guo 等[15]基于葉輪對發(fā)酵液流動性的影響設計了6種不同的葉輪，在7000L的發(fā)酵罐中成功放大并應用，最終其生物量達到128.3g/L，而DHA產量達39.2g/L。因此，在中試放大過程中，除考慮體積傳氧系數(shù)（KLa）外，還應考慮計算流體動力學和生物生理特性分析等諸多方面，才能更進一步提高目標產物的產量[81]。

表3 分階段培養(yǎng)法在破囊壺菌生產DHA中的應用

目前在破囊壺菌中試放大試驗中，由于放大前后不能同時保持所有參數(shù)一致，從而導致實驗室和工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐中細胞培養(yǎng)條件和生理狀態(tài)存在顯著差異[82]。此外，培養(yǎng)規(guī)模的變化會影響發(fā)酵罐環(huán)境的同質性，從而導致發(fā)酵參數(shù)（溶解氧、底物濃度、pH 等）在空間上的分布不均，當細胞生長在不均勻的環(huán)境中并在不同區(qū)域之間穿梭時，這些波動會導致它們的遺傳、轉錄和代謝水平的變化，進而影響目標產品的產量和質量[83-84]?，F(xiàn)有的中試放大技術難以實現(xiàn)裂殖壺菌發(fā)酵既低能耗又高效、高產且可獲得高含量DHA 的目標，因此后續(xù)對破囊壺菌進行中試放大研究仍然是工業(yè)化生產的一大重點。

5 結語

隨著生活水平的不斷提高，人們對DHA 的需求量不斷增加，采用海洋微生物發(fā)酵生產DHA 具有廣闊的市場前景。為了提高破囊壺菌的DHA 產量，傳統(tǒng)的研究主要集中在菌種選育、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，發(fā)酵工藝流程改進等方面。現(xiàn)階段，更多的研究者從DHA 合成路徑入手，通過對多不飽和脂肪酸合成路徑中的基因及相關酶的研究，調控其關鍵酶基因的表達，最終運用基因工程手段提高DHA 的產量[85]。隨著當前對破囊壺菌的基因改造及代謝途徑研究取得的初步進展，利用破囊壺菌大規(guī)?；aDHA仍有很大的進步空間。

目前，在破囊壺菌發(fā)酵生產DHA 方面主要存在以下幾方面的問題：優(yōu)質的種質資源少，細胞生長和油脂積累不穩(wěn)定以及細胞代謝通路不清晰、難以調控，中試放大關鍵因素難以確定等。因此，今后關于破囊壺菌的研究工作應圍繞高產DHA 的破囊壺菌菌株的篩選，對發(fā)酵營養(yǎng)及環(huán)境條件的深入研究，對多不飽和脂肪酸合成通路及菌體代謝調控的研究，DHA 發(fā)酵工藝的放大等方面。以此為實現(xiàn)破囊壺菌生產DHA的工業(yè)化應用奠定理論基礎，從而推動DHA 在醫(yī)藥、食品、保健品、飼料等諸多領域的應用。