李建功 孫文熙 劉家玥 李雪山 薛偉琪 羅川晉

摘 要 目的：基于Toll樣受體4（TLR4）/髓樣分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）信號通路研究黃連素對小鼠巨噬細胞極化的影響。方法：以小鼠巨噬細胞RAW264.7為對象，以阿托伐他汀鈣為陽性對照，經(jīng)脂多糖（LPS）誘導以復制炎癥細胞模型，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測低、中、高劑量黃連素（5、10、20 μmol/L）作用24 h后細胞培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、NF-κB含量，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測細胞中TLR4、MyD88 mRNA的表達水平，采用Western blotting法檢測細胞中TLR4、MyD88、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、CD206蛋白的表達水平。結果：與空白對照組比較，LPS誘導組細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、NF-κB含量，細胞中TLR4、MyD88 mRNA的相對表達量以及TLR4、MyD88、iNOS蛋白相對表達量均顯著升高（P<0.05）。與LPS誘導組比較，阿托伐他汀鈣組和黃連素中、高劑量組TNF-α、IL-6含量，TRL4、MyD88 mRNA及其蛋白的相對表達量以及各給藥組NF-κB含量和iNOS蛋白的相對表達量均顯著降低，且黃連素高劑量組NF-κB含量顯著低于阿托伐他汀鈣組（P<0.05）;阿托伐他汀鈣組和黃連素高劑量組CD206蛋白的相對表達量均顯著升高，且黃連素高劑量組CD206蛋白的相對表達量顯著高于阿托伐他汀鈣組（P<0.05）。結論：不同劑量的黃連素均可不同程度地干預小鼠巨噬細胞極化，其機制可能與調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關。

關鍵詞 黃連素;小鼠巨噬細胞;RAW264.7細胞;極化;Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核因子κB信號通路

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of berberine on mice macrophage polarization based on TLR4-MyD88-NF-κB signaling pathway. METHODS： Using mice RAW264.7 macrophage as the object， atorvastatin calcium as positive control， inflammatory cell model was induced by lipopolysaccharide （LPS）; ELISA method was used to detect the contents of TNF-α， IL-6 and NF-κB in cell culture medium after treated with low， medium and high doses of berberine （5， 10， 20 μmol/L） for 24 h. The real-time fluorescence quantitative PCR was conducted to determine the mRNA expression of TLR4 and MyD88 in cells. Western blotting assay was used to detect the protein expression of TLR4， MyD88， iNOS and CD206 in cells. RESULTS： Compared with blank control group， the contents of TNF-α， IL-6 and NF-κB in cell culture medium， mRNA expression of TLR4 and MyD88， protein expression of TLR4， MyD88 and iNOS in cells were increased significantly in LPS induction group （P<0.05）. Compared with LPS induction group， the contents of TNF-α and IL-6， mRNA and protein expression of TLR4 and MyD88 in atorvastatin calcium group， berberine medium-dose and high-dose groups as well as the content of NF-κB and protein expression of iNOS in administration groups were decreased significantly， while the content of NF-κB in berberine high-dose group was significantly lower than atorvastatin calcium group （P<0.05）. The protein expressions of CD206 in atorvastatin calcium group and berberine high-dose group were increased significantly， while the protein expression of CD206 in berberine high-dose group was significantly higher than atorvastatin calcium group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Different doses of berberine can intervene in mice macrophage polarization to different extents， the mechanism of which may be associated with the regulation of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway.

KEYWORDS? ?Berberine; Mice macrophage; RAW264.7 cell; Polarization; TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病[1]。有研究指出，AS斑塊中存在大量的免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞等[2]。其中，巨噬細胞作為斑塊組織中炎癥因子的主要來源和先天性免疫應答中的主要免疫細胞，在AS的進展過程中發(fā)揮了關鍵作用[3]。巨噬細胞是一種多相細胞，可在不同因子的誘導下極化，即被不同細胞因子激活后活化為M1型或M2型巨噬細胞，其中M1型巨噬細胞分泌的細胞因子具有促AS的作用，M2型巨噬細胞則可增加AS斑塊的穩(wěn)定性[4]。因此有學者指出，調節(jié)巨噬細胞的極化可能成為抗AS作用研究的新靶點[3]。核因子κB（NF-κB）是一種重要的轉錄因子，可參與調控多種與炎癥反應相關的細胞因子、黏附分子的表達，其激活與巨噬細胞極化密切相關[5-6]。脂多糖（LPS）是引起炎癥性疾病的主要原因之一[7]。有研究證實，LPS可通過識別并結合Toll樣受體4（TLR4），經(jīng)TLR4/髓樣分化因子88（MyD88）途徑激活NF-κB[8-9]。

黃連素作為中藥黃連的主要有效成分之一，已有研究證實其可通過抗炎作用抑制AS斑塊的形成[10-11]，但具體機制尚未完全闡明。本研究基于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，初步探討了黃連素對小鼠RAW264.7巨噬細胞極化的干預作用，以期為臨床防治AS提供新的靶點和思路。

1 材料

1.1 儀器

HEPA Class100型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Rotofix 32A型離心機（德國Hettich公司）;SpectraMax Plus 384型全自動酶標儀（美國Molecular Devices公司）;BioDoc-IT型凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）;UV-6100S型紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）;ABI 7500型實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;BT25S型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

黃連素原料藥（批號：HY-N0197，純度：98%）以及胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）、RPMI 1640培養(yǎng)基、蛋白裂解液（RIPA）、TRIzol試劑、實時熒光定量PCR試劑盒（含SYBR熒光染料等試劑）、ECL化學發(fā)光試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（批號分別為ISEQ00010、ISEQ00023、ISEQ00812、WSED00972、WSED08821、WSED56324、CSB-E08324r、CSB-E08453r、CSB-E09971r、CSB-E09576r）均購自廣東晶欣生物科技有限公司;阿托伐他汀鈣片（陽性對照，輝瑞制藥有限公司，批號：6958703500744，規(guī)格：20 mg/片）;二甲基亞砜（DMSO）、脂多糖（LPS）（美國Sigma公司，批號分別為D4540、L2880）;腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、NF-κB酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司，批號分別為SDFGT1589、SDFGT1573、SDFGT15812）;cDNA合成試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：00351597）;兔抗小鼠TLR4、MyD88、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、CD206、甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH）抗體（內參）（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BSD-GS77908、BSD-GS23903、BSD-GS67905、BSD- GS44907、BSD- GS76901）;辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（武漢華美生物工程有限公司，批號：CSB-PA644737）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細胞

小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株由中國科學院上海生科院細胞資源中心提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將RAW264.7細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下（下同）培養(yǎng)48 h，以1 000 r/min離心5 min;棄去上清液，沉淀加入PBS適量，再加入RPMI 1640培養(yǎng)基混勻、重懸并計數(shù)，制成密度為1×106個/mL的細胞懸液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

取“2.1”項下RAW264.7細胞懸液適量，按100 μL/孔接種于96孔板中，并隨機分為空白對照組、LPS誘導組、阿托伐他汀鈣組（10 μmol/L，劑量設置參考文獻方法[12]）和黃連素低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L，劑量設置參考本課題組前期預試驗結果），每組設3個復孔。空白對照組和LPS誘導組均不加入藥物;LPS誘導組加入LPS（終質量濃度為100 μg/L），其余各藥物組經(jīng)相應藥物預處理2 h后再加入等量LPS（終質量濃度為100 μg/L），培養(yǎng)24 h以復制細胞炎癥模型。

2.3 相關指標檢測

2.3.1 細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、NF-κB的含量 采用ELISA法檢測。收集“2.2”項下各組細胞培養(yǎng)液，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，收集上清液，使用全自動酶標儀檢測其中TNF-α、IL-6、NF-κB含量。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。上述試驗重復3次。

2.3.2 細胞中TLR4、MyD88 mRNA的表達量 采用實時熒光定量PCR法檢測。取“2.2”項下各組細胞適量，用PBS清洗后，采用TRIzol法提取細胞總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度（當RNA的A260 nm/A280 nm為1.8～2.0時，才能進行后續(xù)試驗[12]）。按? cDNA合成試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉錄為cDNA并進行PCR擴增。PCR反應體系（20 μL）：cDNA模板4 μL、上/下游引物（序列見表1）各2 μL、SYBR熒光染料10 μL、無核酸酶水2 μL;反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內參，生成擴增曲線和熔解曲線，使用Image J v1.5.1軟件分析并采用2-ΔΔCt法計算TLR4、MyD88 mRNA的相對表達量。上述試驗重復6次。

2.3.3 細胞中TLR4、MyD88、iNOS、CD206蛋白的表達量 采用Western blotting法檢測。取“2.2”項下各組細胞適量，用蛋白裂解液（RIPA）裂解30 min后，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)煮沸5 min變性，取變性蛋白50 μg行SDS-PAGE，電泳結束后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h，加入相應一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;用磷酸鹽吐溫緩沖溶液（PBST）清洗后，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 200），于37 ℃孵育1 h;用PBST溶液清洗后，以ECL化學發(fā)光試劑盒顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像并采用Image J v1.5.1軟件分析，以相應蛋白與內參的灰度值比值表示該蛋白的相對表達量。上述試驗重復6次。

2.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 黃連素對RAW264.7細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、NF-κB含量的影響

與空白對照組比較，LPS誘導組細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、NF-κB含量均顯著升高（P<0.05）。與LPS誘導組比較，阿托伐他汀鈣組和黃連素中、高劑量組細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6含量以及各給藥組NF-κB含量均顯著降低，且黃連素高劑量組NF-κB含量顯著低于阿托伐他汀鈣組（P<0.05），詳見表2。

3.2 黃連素對RAW264.7細胞中TLR4、MyD88 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，LPS誘導組細胞中TRL4、MyD88 mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.05）;與LPS誘導組比較，阿托伐他汀鈣組和黃連素中、高劑量組細胞TRL4、MyD88 mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05），但黃連素高劑量組上述指標與阿托伐他汀鈣組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表3。

3.3 黃連素對RAW264.7細胞中TLR4、MyD88、iNOS、CD206蛋白表達的影響

與空白對照組比較，LPS誘導組細胞中TLR4、MyD88、iNOS蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05）;與LPS誘導組比較，阿托伐他汀鈣組和黃連素中、高劑量組TLR4、MyD88蛋白的相對表達量以及各給藥組iNOS蛋白的相對表達量均顯著降低，阿托伐他汀鈣組和黃連素高劑量組CD206蛋白的相對表達量均顯著升高，且黃連素高劑量組CD206蛋白的相對表達量顯著高于阿托伐他汀鈣組（P<0.05），詳見圖1、表4。

4 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）簡稱“冠心病”，AS是其主要病因之一[13]。關于AS的發(fā)病機制，目前已有炎癥學說、脂質浸潤學說、內皮損傷-反應學說、平滑肌細胞克隆學說等多種學說[1，14-15]。其中，由Ross R[1，15]提出的炎癥學說受到學者的普遍關注，現(xiàn)已成為學界共識[16]。炎癥反應可按致炎物質分為生物性炎癥、免疫性炎癥和化學性炎癥[16]。在各種炎癥反應中，巨噬細胞在細胞因子的刺激下釋放炎癥因子，后者參與炎癥級聯(lián)反應，與AS早期形成密切相關[3，17]。有研究指出，巨噬細胞在不同誘因下可被活化，生成兩種極化分型，即M1型和M2型。M1型巨噬細胞主要分泌TNF-α、IL-6等促炎因子，促進AS的發(fā)生;M2型巨噬細胞主要產生抗炎因子并促進血管新生，可減輕炎癥反應、增加斑塊的穩(wěn)定性[4，18-19]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，AS斑塊組織中同時存在M1和M2型巨噬細胞，且兩種分型細胞的比例與CHD患者病情的嚴重程度相關[20-21]。然而，M1和M2型巨噬細胞的比例并非一成不變，因巨噬細胞可塑性高，即便已經(jīng)極化，不同分型之間仍可相互轉化[22]，故可通過調節(jié)二者的比例來改善AS患者的轉歸與預后。由此可見，尋找可調節(jié)巨噬細胞極化的藥物已成為AS防治研究的新熱點之一。

黃連素是從黃連等藥用植物中提取的活性生物堿類成分，可通過抑制血小板聚集、調節(jié)一氧化氮和一氧化氮合酶、減少活性氧、抑制炎癥因子的生成等途徑來保護血管[23]。AS的病理過程較為復雜，而近年來有關黃連素抗AS的研究亦是從多機制、多靶點進行闡述：Wang Q等[24]認為，黃連素可通過激活腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）而加速低密度脂蛋白（LDL）受體的表達，從而降低AS模型小鼠的脂質代謝;侯宏等[25]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可降低機體血脂水平以減輕AS斑塊病變程度;陳略等[26]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可通過促進平滑肌細胞在受損內膜中的增殖來延緩AS的進展;Zhu L等[27]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可通過調節(jié)腸道菌群、增加益生菌來促進代謝紊亂的恢復，從而改善模型小鼠的AS癥狀。但目前少有研究從巨噬細胞極化這一方面進行探討。為此，本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為對象，初步探討了黃連素對巨噬細胞極化的影響。

阿托伐他汀鈣具有調脂、穩(wěn)斑的作用，已被廣泛應用于AS及其相關疾病的臨床治療中，且亦有研究證實該藥具抗炎、抗血小板等生物活性[28]，因此本研究選用阿托伐他汀作為陽性對照藥物。LPS是一種內毒素，其所致炎癥模型是最常見的炎癥模型。LPS可與位于細胞表面的TLR4結合，活化的TLR4可通過MyD88依賴途徑，激活大量的NF-κB，進而促進巨噬細胞極化調控[29];同時，LPS還可刺激巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6，上述炎癥因子的基因調控區(qū)均包含NF-κB的結合位點[30]。NF-κB為一種蛋白因子，可多向轉錄以調控機體免疫功能，其介導的炎癥反應可促進AS的發(fā)生與發(fā)展[31]。本研究結果顯示，經(jīng)LPS誘導后，細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、NF-κB含量以及細胞中TRL4、MyD88蛋白及其mRNA的相對表達量均較空白對照組顯著升高;經(jīng)藥物預處理后，阿托伐他汀鈣組和黃連素中、高劑量組TNF-α、IL-6含量，TRL4、MyD88蛋白及其mRNA的相對表達量以及各給藥組NF-κB含量均顯著降低，且高劑量組NF-κB含量顯著低于阿托伐他汀鈣組。這提示黃連素可降低炎癥模型細胞的炎癥因子含量，且高劑量黃連素對NF-κB的下調作用優(yōu)于陽性對照藥物;該作用可能與調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關。

在非活化狀態(tài)下，NF-κB通常以其p50亞基/p65亞基異二聚體的形式與NF-κB抑制蛋白結合后被激活，然后與抑制蛋白解離并進入細胞[32]。在激活NF-κB的同時，NF-κB通路可啟動iNOS轉錄，釋放一氧化氮，故iNOS可作為M1型巨噬細胞的標志物[33];CD206在M2型巨噬細胞中呈高表達，是M2型巨噬細胞的標志因子，具有較高的特異性[34];二者的表達高低反映了巨噬細胞主要的極化分型。本研究結果顯示，經(jīng)LPS誘導后，細胞中iNOS蛋白的相對表達量較空白對照組顯著升高。經(jīng)藥物預處理后，各給藥組細胞中iNOS蛋白的相對表達量均顯著降低，阿托伐他汀鈣組和黃連素高劑量組細胞中CD206蛋白的相對表達量均顯著升高，且高劑量組CD206蛋白的相對表達量顯著高于阿托伐他汀鈣組。這提示各劑量的黃連素均可下調iNOS的表達;高劑量的黃連素可上調CD206的表達，且作用強于陽性對照組。這初步證實了黃連素抑制M1型巨噬細胞極化、促進M2型巨噬細胞極化的作用。

綜上所述，黃連素抗AS的機制可能與通過調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，抑制M1型巨噬細胞極化、促進M2型巨噬細胞極化，從而發(fā)揮抗炎作用有關。但其具體作用機制有待后續(xù)研究進一步驗證和完善。

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（收稿日期：2020-01-21 修回日期：2020-05-28）

（編輯：張元媛）