李 錳 ,趙 靜 ,劉紅羽 ,安 雯 ,王 軍* ,呂文發(fā)*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合重點實驗室，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室,吉林長春 130118）

卵巢是雌性哺乳動物繁殖的重要器官，其中卵泡的發(fā)生發(fā)育至關(guān)重要。哺乳動物的大部分卵泡都在生長發(fā)育過程中閉鎖退化，只有極少數(shù)能發(fā)育成熟排卵，這種生理狀態(tài)大大限制了卵泡的充分利用，卵巢顆粒細胞作為卵泡中最重要的體細胞，其在卵泡發(fā)生發(fā)育過程中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的重要原因[1]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在凋亡牛卵巢顆粒細胞中纖溶酶原激活物抑制劑1（Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）基因顯著下調(diào)。PAI-1首先被鑒定為牛主動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中的纖維蛋白溶解抑制劑，但后來發(fā)現(xiàn)它是由許多組織和細胞產(chǎn)生[2]，PAI-1具有抑制纖維蛋白降解、刺激平滑肌細胞增生和促進癌細胞遷移等功能[3-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PAI-1在排卵過程中起關(guān)鍵作用，且人絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，hCG）和前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）可提高顆粒細胞PAI-1表達[6-7]，但PAI-1基因在牛顆粒細胞凋亡中的作用機理尚不清楚。本實驗旨在構(gòu)建PAI-1真核表達載體，并對其生理功能進行初步研究，為進一步研究PAI-1基因在牛卵巢顆粒細胞凋亡中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗所使用的卵巢組織取自于長春市屠宰場，從剛屠宰的母牛體內(nèi)取出，置于37℃生理鹽水中3～6 h內(nèi)運回實驗室，采用抽吸法提取顆粒細胞。293T細胞由吉林大學唐小春老師惠贈。

1.2 主要試劑 DH5α感受態(tài)細胞（貨號：CB101）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（貨號：DP209）、質(zhì)粒小提試劑盒（貨號：DP101）、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑（貨號：DP117）購自北京天根生化科技有限公司，DL2000 DNA Marker（貨號：3427A）、T4 DNA Ligase（貨號：2011A）、EcoR Ⅰ（貨號：1040A）、Hind Ⅲ（貨號：1060A）、Premix Taq酶（貨 號：RR901A）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR047A）、RT-qPCR試劑盒（貨號：RR820A）購自TaKaRa公司，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（貨號：P0012AC）、BCA蛋白定量試劑盒（貨號：P0010）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，lip2000（貨號：11668019）購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布的牛PAI-1基因CDS序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成擴增全長引物，并分別在上下游引物的5′端添加EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位點和保護堿基（下劃線部分）。牛PAI-1和人Bcl2、Bax、Caspase-3和β-actin熒光定量引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成，引物信息見表1。

1.3.2 牛PAI-1基因CDS序列全長擴增 將提取的牛卵巢顆粒細胞經(jīng)Trizol法提取總RNA，按照試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板對PAI-1基因進行PCR擴增，20 μL PCR反應(yīng)體系：Premix Taq 10 μL、上、下游引物（100 pmol/μL）各0.5 μL、cDNA 3 μL、ddH2O補足至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃徹底延伸10 min。配制1% 瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳觀察。

1.3.3 牛PAI-1基因克隆載體構(gòu)建 按照膠回收試劑盒要求，對PAI-I基因PCR產(chǎn)物進行膠回收，與pMD-19-T載體16 ℃連接過夜，連接體系為：pMD-19-T 1 μL，膠回收產(chǎn)物4.0 μL，Solution I 5.0 μL。熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，均勻涂布至帶有氨芐抗性的固體LB培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)過夜，隨機挑取4～7個單個陽性菌落接種于帶有氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中擴繁，經(jīng)質(zhì)粒提取雙酶切鑒定陽性的菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，經(jīng)測序鑒定與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的PAI-1基因CDS序列完全匹配的克隆載體命名為pMD-19-T-PAI-1。

1.3.4 牛PAI-1基因真核表達載體構(gòu)建 使用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ對pMD-19-T-PAI-1和pcDNA3.1（+）進行雙酶切，膠回收PAI-1基因片段和線性化pcDNA3.1（+）并將回收片段連接，連接體系：T4 DNA Ligase 1 μL，10×Buffer 1 μL，線性化pcDNA3.1（+）1 μL，PAI-1基因片段7 μL，16℃連接過夜。熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后采用1.3.3克隆載體鑒定方法進行鑒定，經(jīng)測序鑒定與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的PAI-1基因CDS序列完全匹配的真核表達載體命名為pcDNA3.1-PAI-1。

1.3.5 生物信息學分析 使用NCBI中Blast功能（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對牛PAI-1基因編碼氨基酸序列進行同源性比對；使用Prot-Param在線分析軟件（https://www.expasy.org/protparam）分析PAI-1基因編碼的氨基酸組成、理論分子質(zhì)量、等電點等基本理化性質(zhì)；利用在線軟件NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）分析PAI-1蛋白的潛在磷酸化位點；利用TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP），PSORT Ⅱ（http://psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測PAI-1蛋白的亞細胞定位；利用DNAStar-Protean軟件預(yù)測PAI-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.6 陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細胞 將293T細胞接種于6孔板中，接種密度為7.5×105個/孔，培養(yǎng)24 h后，按照lip2000說明書分別將pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1-PAI-1轉(zhuǎn)染至293T細胞內(nèi)，6 h后添加胎牛血清至終濃度為10%，24 h后更換10%胎牛血清培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞提取RNA和蛋白。

表1 PCR引物信息

1.3.7 熒光定量PCR（RT-qPCR）采用Trizol法提取293T細胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL、上下游引物（100 pmol/μL）各0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性120 s，95℃變性15 s，退火34 s，擴增40個循環(huán)。運用2－△△Ct方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.8 Western Blot使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，對提取蛋白進行SDS-PAGE電泳，蛋白上樣量為40 μg，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，Block Buffer封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗滌5 min，共洗滌5次，二抗孵育1 h，1×TBST洗滌5 min，共洗滌5次，隨后用ECL發(fā)光液顯影，用Tanon Gis軟件進行灰度值分析。Western Blot抗體信息見表2。

表2 Western Blot抗體信息

1.4 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，使用GraphPad prism 5.0對數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛PAI-1基因擴增 以牛卵巢顆粒細胞cDNA為模板，使用擴增全長引物進行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，條帶大小符合目的基因預(yù)期擴增片段,約1 226 bp，說明成功擴增出牛PAI-1基因CDS全長序列。

2.2 牛PAI-1基因克隆載體與真核表達載體構(gòu)建 經(jīng)連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒，使用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ對克隆載體pMD-19-T-PAI-1和真核表達載體pcDNA3.1-PAI-1進行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，酶切條帶符合預(yù)期片段大小，約為1 215 bp。測序結(jié)果經(jīng)Blast比對，測序片段與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的PAI-1基因CDS序列完全匹配（圖3）。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 基本理化性質(zhì) 牛PAI-1基因編碼氨基酸序列與綿羊、馬、豬、人、狗、大鼠、小鼠PAI-1基因編碼氨基酸序列的同源性分別為95.52%、86.43%、89.55%、85.32%、88.06%、78.86%、76.87%，提示PAI-1基因在不同物種間相對保守。牛PAI-1基因共編碼402個氨基酸，分子式為C2042H3189N539O590S20，分子量為45.37 ku，理論等電點為5.96。如表3所示，PAI-1蛋白共包含20種氨基酸，亮氨酸含量最高，為10.4%，半胱氨酸含量最低，為0.2%，包含44個負電荷氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）和39個正電荷氨基酸（精氨酸+賴氨酸）。

表3 PAI-1蛋白氨基酸組成

2.3.2 磷酸化位點、亞細胞定位分析 在牛PAI-1蛋白中，共預(yù)測到35個磷酸化位點，其中21個絲氨酸磷酸化位點、11個蘇氨酸磷酸化位點、3個酪氨酸磷酸化位點。PAI-1蛋白的亞細胞定位結(jié)果顯示，線粒體作用位點占比3.2%，分泌信號作用位點占比98%，說明該蛋白為分泌型蛋白。PAI-1蛋白主要分布在細胞外，其次分布在液泡內(nèi)，在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞質(zhì)也有分布（表4）。

表4 PAI-1蛋白亞細胞定位

2.3.3 二級結(jié)構(gòu)分析 PAI-1蛋白二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，PAI-1蛋白包括24個α螺旋、30個β轉(zhuǎn)角、19個T轉(zhuǎn)角和18個無規(guī)卷曲（圖4）。

2.4 牛PAI-1基因在293T細胞中表達情況 如圖5-A和圖6-D所示，牛PAI-1基因在293T細胞中成功表達，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PAI-1組中PAI-1基因mRNA表達比轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）組高達4 000多倍，蛋白水平顯著升高，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）組未檢測出相應(yīng)條帶。

2.5 RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA表達 使用RT-qPCR檢測不同轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)基因Bcl2、Bax和Caspase-3mRNA的表達，結(jié)果如圖5所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PAI-1組中抗凋亡基因Bcl2的mRNA水平極顯著升高，促凋亡基因Bax的mRNA水平顯著降低，Caspase-3的mRNA水平極顯著降低。結(jié)果表明，PAI-1能夠抑制細胞凋亡。

2.6 Western Blot檢測凋亡相關(guān)基因蛋白表達 由圖6可知，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PAI-1組中抗凋亡基因Bcl2的蛋白水平極顯著升高，促凋亡基因Bax和Cleaved-caspase3的蛋白水平極顯著降低。上述結(jié)果表明，PAI-1能夠抑制細胞凋亡，與mRNA檢測結(jié)果一致。

3 討論

表達載體構(gòu)建技術(shù)是一項較為成熟的基因工程技術(shù)，將質(zhì)粒作為載體，使目的基因片段與載體相連轉(zhuǎn)化入細胞使目的基因過表達，常用來研究目的基因在生物過程中的作用。本實驗成功構(gòu)建了牛PAI-1真核表達載體，為進一步研究PAI-1在牛卵巢顆粒細胞凋亡過程中作用及機制提供技術(shù)支持。

生物信息學分析結(jié)果顯示，PAI-1蛋白屬于分泌型蛋白，亞細胞定位顯示主要分布在細胞外，這與其參與凝血功能相一致?？傆嬵A(yù)測到35個磷酸化位點，而蛋白磷酸化對于細胞信號傳導具有重要作用，說明PAI-1可能參與細胞信號傳導。

PAI-1作為纖溶系統(tǒng)中的重要一環(huán)，參與纖維蛋白溶解過程，先前研究主要集中PAI-1在心血管系統(tǒng)中的重要作用[8]，但PAI-1在機體很多細胞都可以合成和分泌，提示其具有多種功能，多項研究表明PAI-1參與癌癥、糖尿病、腎病等疾病過程[9-11]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，PAI-1基因表達量在凋亡牛卵巢顆粒細胞中顯著下調(diào)，提示其可能在牛卵巢顆粒細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。PAI-1在抗細胞凋亡方面有重要作用，如在成纖維細胞中，過表達PAI-1可以降低Caspase-3水平，并通過促進p-ERK和p-AKT蛋白分子表達激活ERK和AKT信號通路促進細胞增殖，抑制成纖維細胞凋亡[12]。間充質(zhì)干細胞（MSC）對熱灼傷皮膚傷口產(chǎn)生有利的治療作用，其中上調(diào)的細胞因子PAI-1等可能通過激活PI3K/AKT信號通路來緩解人角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞凋亡促進傷口愈合[13]。此外，大鼠在LPS誘導的急性肺損傷期間，PAI-1可提高Bcl2水平，表現(xiàn)抗凋亡作用[14]。293T細胞是一種常用于研究外源基因表達和功能的細胞株，并且轉(zhuǎn)染容易，本實驗結(jié)果與上述結(jié)果相似，即轉(zhuǎn)染過表達PAI-1可顯著提高293T細胞中Bcl2水平，降低Bax和Caspase-3水平，顯示出抗凋亡作用。本實驗僅在293T細胞中進行初步探究，PAI-1在牛卵巢顆粒細胞凋亡中的作用還需進一步研究。

4 結(jié)論

本實驗從牛卵巢顆粒細胞克隆出PAI-1基因CDS全長序列，基因編碼402個氨基酸，預(yù)測到35個磷酸化位點，主要分布在細胞外。本研究成功構(gòu)建PAI-1基因克隆載體和真核表達載體，在293T細胞中轉(zhuǎn)染PAI-1真核表達載體后，細胞內(nèi)可成功過表達，并顯示出PAI-1抑制細胞凋亡的功能。