關(guān)樺楠，宋巖，劉博，韓博林，龔德?tīng)?，彭博，張?/p>

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076)

亞硫酸鹽是食品加工領(lǐng)域的必需品，具有貯藏保鮮、殺菌、漂白、增酸等作用，在食品工業(yè)中常用作防腐劑以抑制酶促和非酶促褐變，并且在釀造工業(yè)中用作抗菌劑和抗氧化劑[1-3]。作為一種傳統(tǒng)的食品添加劑，亞硫酸鹽在新鮮的水果和蔬菜、果脯、果汁、葡萄酒、淀粉類(lèi)產(chǎn)品以及海產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用，可延長(zhǎng)食品的貯藏時(shí)間，確保許多加工食品和飲料的營(yíng)養(yǎng)充足性、適口性和安全性[4-6]。自20世紀(jì)以來(lái)，亞硫酸鹽的安全問(wèn)題就已經(jīng)引起人們的重視。亞硫酸鹽是一種常見(jiàn)的過(guò)敏原，易引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。它能與蛋白質(zhì)巰基進(jìn)行反應(yīng)，過(guò)量攝入或長(zhǎng)期攝入會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定的損傷。而在其使用過(guò)程中釋放的二氧化硫?qū)C(jī)體的多種器官均有毒理作用，是一種全身性毒物[7,8]。因此，我國(guó)及世界其他國(guó)家和組織都制定了亞硫酸鹽在食品加工過(guò)程中的限量標(biāo)準(zhǔn)[9]。但在實(shí)際加工生產(chǎn)中，人為添加劑量過(guò)大甚至濫用亞硫酸鹽防腐劑的現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生，極易對(duì)人體神經(jīng)、呼吸及消化系統(tǒng)產(chǎn)生危害[10]。在食品加工領(lǐng)域，亞硫酸鹽的毒性作用不可忽視，因此建立有效的檢測(cè)方法就顯得尤為重要。目前，應(yīng)用于食品中亞硫酸鹽檢測(cè)的方法主要有離子色譜法、電化學(xué)傳感器及熒光分析法[11-14]，具有靈敏度高、檢測(cè)限低、可靠性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但存在前處理復(fù)雜和需要大型儀器等缺點(diǎn)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[15]。因此，針對(duì)亞硫酸鹽建立簡(jiǎn)單、快速和精準(zhǔn)的可視化檢測(cè)體系具有重要的應(yīng)用價(jià)值和實(shí)際意義。

Fe3O4@Au納米微粒具有模擬過(guò)氧化物酶活性，能夠有效地催化ABTS產(chǎn)生顯色反應(yīng)[16]。與天然酶相比，具有制備簡(jiǎn)單、成本低廉、穩(wěn)定性高、催化性能可調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，可替代天然酶應(yīng)用于酶法食品分析及食品安全快速檢測(cè)[17]。本課題組曾報(bào)道了金磁微粒模擬酶用于食品中葡萄糖的比色檢測(cè)[18]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種基于Fe3O4@Au納米微粒催化特性的亞硫酸根快速檢測(cè)方法，利用亞硫酸根離子具有較強(qiáng)的還原性，可使氧化的顯綠色的ABTS+褪色為ABTS的原理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)亞硫酸根的比色傳感檢測(cè)。試驗(yàn)中建立了最優(yōu)的比色傳感體系，探討了體系的抗干擾性，為實(shí)現(xiàn)食品中亞硫酸鹽的快速定量檢測(cè)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鐵(FeCl3·H2O)、醋酸鈉(NaAc·3H2O)、無(wú)水醋酸鈉、冰醋酸、PEG-4000、氯金酸、過(guò)氧化氫：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙二醇：天津市華東試劑廠；乙醇：上海振興化工一廠；2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)：淮安和元化工有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FC204型電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；YZHR-25型水熱反應(yīng)釜 上海耀冠儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；H-113ATC型分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；VSM LDJ 9600型振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì) 北京翠海佳誠(chéng)磁電科技有限責(zé)任公司；Advanced-D8型X-射線粉末衍射儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4納米粒子的制備

將1.35 g的FeCl3·6H2O溶于40 mL乙二醇中，依次加入3.6 g的NaAc·3H2O與1.0 g PEG-4000，形成均一的溶液，再攪拌30 min。向水熱反應(yīng)釜中倒入攪拌后的溶液，200 ℃保持8 h，結(jié)束后冷卻至室溫，所得黑色的產(chǎn)物用乙醇和水各洗滌3次。

1.3.2 金納米粒子的綠色制備

將10 g新鮮橘子皮粉碎后浸泡于100 mL的去離子水中，再將浸泡液于4000 r/min條件下，離心3 min后取上清液。此上清液作為工作液，于冰箱4 ℃條件下保存。在室溫條件下啟動(dòng)磁力攪拌器，在燒杯中加入20 mL提前4 ℃預(yù)冷的氯金酸溶液中(1%，W/V)，溫和攪拌。待2 min后，迅速加入5 mL預(yù)先制備的橘皮浸泡工作液，并立即觀察有無(wú)顏色上的變化，即由黃色變成紫色后再變?yōu)榫萍t色，當(dāng)變?yōu)榫萍t色時(shí)，提高攪拌速度，10 min后制得金納米粒子，隨即將其置于冰箱4 ℃條件下保存。

1.3.3 金磁微粒的制備

取2 g合成的Fe3O4納米微粒超聲分散在50 mL含有20%乙醇水溶液中，室溫條件下，邊攪拌邊緩慢滴加1 mL APTES，7 h后得到淺棕色帶細(xì)微顆粒的懸濁液即為反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物即為氨基化修飾后的Fe3O4納米微粒。此產(chǎn)物用0.1 mol/L的HCl-乙醇溶液磁分離清洗3次，烘干后備用。取上述制備的氨基修飾的Fe3O4納米微粒2 g于室溫下150 r/min攪拌中迅速加入20 mL所制備的金納米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐漸變淡，低速攪拌反應(yīng)12 h后，獲得金磁微粒Fe3O4@Au。

1.3.4 表征

將制備的磁性材料粉末用適量的蒸餾水稀釋?zhuān)糜诔暡ㄇ逑雌魃铣曊袷幨蛊渚鶆蚍稚?。采用X-射線粉末衍射儀對(duì)Fe3O4@Au結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，在室溫下通過(guò)振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)測(cè)量Fe3O4@Au的磁學(xué)性能。用適量的蒸餾水稀釋磁性材料的合成粉末并使其均勻并通過(guò)超聲波清洗分離。Fe3O4@Au的結(jié)構(gòu)用X射線粉末板表征，F(xiàn)e3O4@Au的磁性能在室溫下由振蕩器測(cè)量。

1.3.5 單因素優(yōu)化金磁微粒檢測(cè)亞硫酸根的體系

體系中加入3 mL HAc-NaAc 緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.4)，500 μL的H2O2(0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 mol/L)，200 μL 的ABTS溶液(25 mmol/L)，100 μL的納米Fe3O4@Au粉末混懸液(0.1 g/mL)，將反應(yīng)體系放置于(30，40，50，60，70 ℃)水浴鍋中，水浴30 min后(水浴過(guò)程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)一次)取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm處打的吸光度，再加入200 μL亞硫酸鈉溶液(0.01 mol/L)反應(yīng)(5 s、10 s、30 s、1 min、2 min)測(cè)定420 nm處的吸光度。重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算反應(yīng)前后吸光度差值。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化檢測(cè)體系

根據(jù)正交設(shè)計(jì)表選擇 L9(34)正交試驗(yàn)，體系中加入3 mL HAc-NaAc 緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.4)，500 μL不同濃度的H2O2，200 μL的ABTS溶液(25 mmol/L)，100 μL的納米Fe3O4@Au粉末混懸液(0.1 g/mL)，將反應(yīng)體系放置于不同溫度的水浴鍋中，水浴30 min后(水浴過(guò)程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)一次)取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm處的吸光度，再加入200 μL亞硫酸鈉溶液(0.01 mol/L)反應(yīng)不同時(shí)間后測(cè)定420 nm處的吸光度。重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算反應(yīng)前后吸光度差值。確定因素影響的主次順序及優(yōu)選方案。

1.3.7 亞硫酸根檢測(cè)體系工作曲線、檢測(cè)限、回收率和選擇性的測(cè)定

在最適濃度、最適溫度、時(shí)間體系下，加入3 mL HAc-NaAc 緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.4)，500 μL的H2O2，200 μL 的ABTS溶液(25 mmol/L)，100 μL的納米Fe3O4@Au粉末混懸液(0.1 g/mL)，將反應(yīng)體系放置于水浴鍋中，水浴30 min后(水浴過(guò)程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)一次)取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm處的吸光度，再加入200 μL亞硫酸鈉溶液(0.001，0.0025，0.005，0.0075，0.01，0.02 mol/L)反應(yīng)后測(cè)定420 nm處的吸光度。重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算反應(yīng)前后吸光度差值。根據(jù)不同濃度亞硫酸根與吸光度值差值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算最低檢出限和回收率。在正交試驗(yàn)優(yōu)化的條件下向檢測(cè)體系中分別添加0.2 mol/L的PO34-、SO42-、Ca2+、Mg2+、Cl-、Na+、K+作為對(duì)比體系進(jìn)行反應(yīng)，掃描體系的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 軟件處理，并采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金磁微粒的表征

對(duì)所制備的Fe3O4納米粒子用硅烷偶聯(lián)劑APTES進(jìn)行表面改性，APTES改性的目的是在磁性粒子的表面形成一層分子結(jié)合劑。在介孔孔道中引入帶正電荷的氨基，有利于中和反應(yīng)機(jī)制的進(jìn)行，并能利用靜電力、氫鍵的相互作用有效提高對(duì)金納米粒子的吸附能力[19]。

由圖1可知，基于JCPDS 19-0629卡，衍射峰(111)和(311)對(duì)應(yīng)Au；衍射峰(220)、(311)、(400)、(511)、(422)和(440)對(duì)應(yīng)Fe3O4，說(shuō)明該微粒中含有Au和Fe3O4。其中，(111)和(311)對(duì)應(yīng)的衍射峰2θ為38.56°和77.58°，基于JCPDS 80-3697卡，結(jié)果表明Fe3O4@Au中所負(fù)載的金納米粒子為催化裂化型晶格，有助于提升金磁微粒的催化性能。Fe3O4衍射峰所對(duì)應(yīng)的2θ為30.17°、35.54°、43.27°、53.62°、57.11°、62.85°，基于JCPDS 19-0629卡，結(jié)果表明Fe3O4@Au中的Fe3O4為立方反尖晶石結(jié)構(gòu)，具備較好的磁電性能。

圖1 金磁微粒X-射線衍射圖譜Fig.1 X-ray diffraction map of gold magnetic particles

由圖2可知，氨基化Fe3O4和Fe3O4@Au的磁學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，飽和磁化值分別為78 emu/g和59 emu/g，說(shuō)明金納米粒子的吸附弱化了磁核的磁性。包覆Au的含量升高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合微粒磁化強(qiáng)度的輕微降低，這一結(jié)論和其他同類(lèi)磁性納米復(fù)合微粒的磁學(xué)性質(zhì)一致[20]。磁學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，氨基化作用后其依然具有超順磁性，磁飽和強(qiáng)度值(M)為 43 emu/g，說(shuō)明氨基化作用不會(huì)顯著影響磁球的超順磁性特點(diǎn)。與納米Fe3O4相比，氨基化Fe3O4納米粒子的磁飽和，可有效防止納米磁球聚合，使得納米磁球能夠穩(wěn)定地分散在水溶液中。

圖2 氨基化Fe3O4和金磁微粒的磁滯回線Fig.2 The hysteresis loop of aminated Fe3O4 and gold magnetic particles

2.2 不同催化條件對(duì)Fe3O4@Au模擬酶檢測(cè)體系的影響

2.2.1 過(guò)氧化氫濃度對(duì)檢測(cè)體系的影響

由圖3可知，過(guò)氧化氫的濃度對(duì)模擬酶檢測(cè)亞硫酸根體系有直接影響。H2O2濃度在0.005～0.05 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，吸光度差值隨H2O2濃度的增加呈快速上升趨勢(shì)。H2O2濃度在0.05～0.1 mol/L時(shí)，隨H2O2濃度的增加，吸光度差值處于緩慢增加階段。H2O2濃度在0.1～0.5 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，體系中H2O2濃度較高，SO32-被消耗，用來(lái)還原ABTS+的離子減少，吸光度差值呈下降趨勢(shì)。由此可知，H2O2濃度在0.1 mol/L時(shí)檢測(cè)效果最好。因此，H2O2濃度因素選擇0.05，0.1，0.5 mol/L這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 過(guò)氧化氫濃度對(duì)檢測(cè)體系的影響結(jié)果Fig.3 Effect of hydrogen peroxide concentration on detection system

2.2.2 催化溫度對(duì)檢測(cè)體系的影響

由圖4可知，溫度在30～60 ℃范圍內(nèi)，隨著催化溫度不斷升高，吸光度差值呈上升趨勢(shì)。在固定化溫度為60～70 ℃以后，吸光度差值緩慢平穩(wěn)上升，表明隨著溫度的升高，模擬酶的催化活性增強(qiáng)，溫度越高檢測(cè)效果越好?？紤]到過(guò)高溫度不適用于即時(shí)檢測(cè)，以及在60 ℃以后體系的反應(yīng)速率變緩，因此，催化溫度因素選擇吸光度差值最好的3個(gè)水平50，60，70 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 催化溫度對(duì)檢測(cè)體系的影響結(jié)果Fig.4 Effect of catalytic temperature on detection system

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)體系的影響

由圖5可知，反應(yīng)時(shí)間在5～10 s時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度差值呈上升趨勢(shì)。時(shí)間在10～60 s時(shí)，吸光度差值呈緩慢平穩(wěn)下降趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間在60～120 s時(shí)，吸光度差值呈快速下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，當(dāng)H2O2濃度和催化溫度相同時(shí)，在5～10 s內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，亞硫酸根檢測(cè)效果越好。在10～60 s范圍內(nèi)檢測(cè)速率變慢，檢測(cè)效果基本達(dá)到最優(yōu)，過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間不利于快速檢測(cè)，因此10 s為最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間因素選擇10，30，60 s這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)體系的影響結(jié)果Fig.5 Effect of reaction time on detection system

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)Fe3O4@Au模擬酶催化體系進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 1 Analysis of orthogonal experiment design and results

由表1極差分析結(jié)果可知，3個(gè)因素對(duì)Fe3O4@Au模擬酶催化體系的影響由大到小依次為H2O2濃度(A)>催化溫度(B)>反應(yīng)時(shí)間(C)。在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，得到Fe3O4@Au模擬酶催化體系的優(yōu)化條件為A2B3C3，即H2O2濃度為0.1 mol/L，催化溫度為70 ℃，反應(yīng)時(shí)間為60 s。綜合上述分析，可以說(shuō)明H2O2濃度是影響檢測(cè)體系的主要因素，催化溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系也有相應(yīng)的影響。

2.4 亞硫酸根檢測(cè)體系的響應(yīng)效果

2.4.1 最低檢出限及回收率

對(duì)不同濃度的亞硫酸根做工作曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 亞硫酸根檢測(cè)體系工作曲線Fig.6 Standard curve of sulfite ion detection system

在最優(yōu)反應(yīng)條件下，反應(yīng)體系在420 nm處吸光度的降低程度ΔA(y)與亞硫酸根的濃度c(x)成正比，亞硫酸根濃度在 0.001～0.02 mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性方程為 y=67.652x+0.0713(R2=0.9872)，檢測(cè)限為1.47 μmol/L，樣品回收率為95.26%～110%。

在相同反應(yīng)體系下，定量檢測(cè)0.01，0.005 mol/L亞硫酸根溶液的吸光度值，帶入工作曲線回歸方程，樣品回收率分別為95.20%和102.36%，說(shuō)明建立的檢測(cè)方法符合檢測(cè)準(zhǔn)確度和重復(fù)性的要求。

2.4.2 檢測(cè)體系選擇性研究

選擇性是比色檢測(cè)體系的重要指標(biāo)。試驗(yàn)過(guò)程考察了檢測(cè)體系的選擇性，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 亞硫酸根檢測(cè)體系的選擇性Fig.7 Selectivity of sulfite ion detection system

亞硫酸根檢測(cè)體系與其他干擾離子檢測(cè)體系的差異度非常顯著，PO34-、SO42-、Ca2+、Mg2+、Cl-、Na+、K+基本不干擾亞硫酸根離子的測(cè)定，說(shuō)明該模擬酶檢測(cè)亞硫酸根的體系具有較高的檢測(cè)特異性，不需要掩蔽這些離子。

3 結(jié)論

本文以Fe3O4@Au納米材料作為過(guò)氧化物模擬酶建立一種靈敏度高、選擇性好的亞硫酸根快速比色檢測(cè)方法。將使用APTES氨基化修飾的磁性Fe3O4微粒和金納米粒子采用組裝法制備Fe3O4@Au復(fù)合材料，利用其催化活性建立亞硫酸根檢測(cè)體系，探求體系最優(yōu)工藝組合，評(píng)估體系檢測(cè)性能。結(jié)果表明：氨基化后的Fe3O4納米粒子負(fù)載金納米粒子有助于提高金磁微粒的催化性能，基于其過(guò)氧化物模擬酶的活性建立的亞硫酸根檢測(cè)方法特異性好、準(zhǔn)確且可重復(fù)。該研究使現(xiàn)場(chǎng)快速可視化檢測(cè)亞硫酸根的方法變得更加多元，為實(shí)際樣品中亞硫酸根的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。