王鑫蕊

摘 要： 工業(yè)用脂肪酶主要來源于酵母和細菌，最適溫度和pH范圍多為35～45℃和6.5～8.0，適應中低溫和偏中性的應用環(huán)境。目前，中低溫脂肪酶在工業(yè)應用中存在一些普遍問題，如高溫或堿性等條件下易失活等，這在一定程度上限制了脂肪酶的工業(yè)應用。在此背景下，人們逐漸關注來自于極端微生物的極端脂肪酶資源的挖掘，如嗜熱脂肪酶、堿性脂肪酶、低溫脂肪酶及綜合多極端脂肪酶等，以達到工業(yè)應用要求。其中，嗜熱脂肪酶多從嗜熱菌中分離得到，具有催化效率高、冷卻能耗低、改善底物可溶性等優(yōu)點，且在應用時較中低溫酶更穩(wěn)定。耐堿脂肪酶則多從土壤、鹽堿湖的耐堿菌中分離得到，常用于洗滌清潔工業(yè)。目前報道的嗜熱耐堿脂肪酶多來源于芽孢桿菌，其適宜溫度在40～60℃之間，最適pH在7.0～9.0之間。本文主要對微生物脂肪酶的性質及應用做論述。

關鍵詞： 微生物;脂肪酶;性質;應用

【中圖分類號】TU74 ? ? 【文獻標識碼】A ? ? 【文章編號】1674-3733（2020）13-0246-01

引言

生物催化劑因其環(huán)保、高效和特異性等特點而廣泛應用于各工業(yè)領域。脂肪酶是自然界中最具潛力的工業(yè)酶之一，能催化水解、酯化、酯交換等反應，在食品營養(yǎng)、油脂化學工業(yè)等方面有較好應用。微生物也是酶資源的重要來源，微生物酶的研究從20世紀90年代開始興起，以蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等產業(yè)價值高的酶類作為主要研究對象。微生物的低溫酶與耐鹽酶等結構和功能新穎的極端酶憑借其獨特的催化作用大大拓寬了微生物酶的應用范圍，也給酶工程的研究帶來了新的思路和方向。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌Top10和BL21菌株由本實驗室保存。引物由上海生工有限公司合成。TaqDNA聚合酶、限制性內切酶和T4DNALigase購于Takara生物技術公司。胰化蛋白胨、酵母提取物等購于Oxoid公司，常用生物試劑卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購于BIOFROXX。系列底物對硝基苯酯（p-NP）和系列脂肪酸甲酯標準品都購于Sigma公司。月桂醇醚磷酸酯、十二烷基硫酸鈉（SDS）、月桂酸鈉（LAS）、吐溫80（Tween80）、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（（PMSF）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、磷酸二氫鈉、甘氨酸、氫氧化鈉等購于國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑未經特殊指明均為分析純試劑。

1.2 重組質粒

pET28a-TLL1的構建根據大腸桿菌優(yōu)勢密碼子，對獲得的TlLipA氨基酸序列（GenbankNo.SHG68904.1）進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化的TlLipA基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司通過全基因合成。分別以NcoI和EcoRI對TlLipA基因（tll1）及pET28a進行雙酶切反應，酶切后將質粒pET28a和tll1連接，轉化至大腸桿菌Top10中，經驗證，獲得正確的重組質粒pET28a-TLL1。

1.3 重組脂肪酶

TlLipA酶學性質的表征方法最適反應溫度的測定：在45～85℃溫度范圍內分別測定酶活力，以最高酶活力為100%計;熱穩(wěn)定性的測定：將酶液于55～70℃分別保溫不同時間，測定酶活力，以初始酶活力為100%計。最適反應pH的測定：在pH4.0～11.0范圍內分別測定重組脂肪酶TlLipA的酶活力，以最高酶活力為100%計;pH穩(wěn)定性的測定：將酶液于不同pH緩沖液中室溫（25℃）放置1h，測定酶活力，以初始酶活力為100%計。金屬離子和化學試劑對酶影響的測定：在反應體系中加入不同的金屬離子及化學試劑至其終濃度為1mmol/L，Tween80終濃度為0.05%（質量分數），混合保溫1h后，測定酶活力，以加入等量蒸餾水的酶樣品為對照。底物特異性的測定：測定重組脂肪酶TlLipA對不同碳鏈長度對硝基苯酯（p-NP）的偏好特性。測定的底物如下：棕櫚酸對硝基苯酯（p-NPP，C16）、肉豆蔻酸對硝基苯酯（p-NPM，C14）、月桂酸對硝基苯酯（p-NPL，C12）、癸酸對硝基苯酯（p-NPD，C10）、辛酸對硝基苯酯（p-NPO，C8）、己酸對硝基苯酯（p-NPC，C6）、乙酸對硝基苯酯（p-NPA，C2）。動力學反應參數的測定：取不同濃度（0.1～2mmol/L）的p-NPP在最適條件下與純化的TlLipA反應，測定酶活力，用Sigma-Plot軟件作圖，得出動力學反應參數。

2 微生物脂肪酶的應用

2.1 重組GZEL酶蛋白制備

GZEL在無任何表面活性劑條件下，以三辛酸甘油酯為底物，測定不同pH條件下的脂肪酶活力。結果表明：不同pH條件下的脂肪酶活力呈典型的鐘形曲線。脂肪酶活性在pH=5.0條件下最大，為（1.48±0.07）×105U/g;以大豆來源L-α-磷脂酰膽堿為底物時，測得該酶在不同pH條件下的磷脂酶活力曲線，結果表明，在pH=6.0時表現出最大的磷脂酶活性，活力為3506.94±274.47U/g。在無任何表面活性劑存在條件下，脂肪酶GZEL的選擇性指數為42.2該結果與之前報道的乳化法測定所得的結果相吻合（41.57）。本文測定GZEL發(fā)揮脂肪酶活力的最適反應pH與之前報道的以橄欖油乳化法反應體系測得的結果有所不同（pH7.0）。這可能與反應體系和反應底物不同有關。在本研究中，選取了常見的不同類型表面活性劑：陰離子型：N-月桂酰肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、脫氧膽酸鈉（NaTDC）;陽離子型：十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）、苯扎氯銨（DDBAC）;非離子型：聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷;兩性離子型：3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽（CHAPS）、十二烷基磺丙基甜菜堿作為代表。同時每種表面活性劑參照其各自臨界膠束濃度值選取三種不同濃度（CMC）來測定不同表面活性劑濃度條件下脂肪酶GZEL在不同pH（2.0～11.0）下對應脂肪酶活力和磷脂酶活力。

2.2 金屬離子

銅離子對不同脂肪酶的影響有著很大的不同。銅離子能夠激活NCIM3639脂肪酶的活性，但對其他絕大部分脂肪酶都產生抑制作用。而汞離子與鐵離子對絕大部分脂肪酶都表現為抑制作用。

結語

在微生物酶的研究內容上，篩選、基因克隆表達和酶的純化與性質研究是主流，酶催化機理和晶體結構解析等更深入的研究較少，蛋白質工程改造工作也不多。酶分子改造能進一步提高酶的工作效能，而理論研究是蛋白質工程的重要指導，可以預期今后會有更多微生物酶理論研究及分子改造工作。

參考文獻

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