彭川 胡明亮 李圣杰

【摘 ?要】目的：分析miR-223-5p、BMP4與大鼠脊髓損傷的相關(guān)性;方法：選取40只標(biāo)準(zhǔn)大鼠，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，每組各20只。觀察組大鼠采用Allens法制備，對(duì)照組僅暴露脊髓。分別觀察兩組大鼠在術(shù)后2h、6h和12h的脊髓損傷情況。其中，miR-223-5p進(jìn)行基因擴(kuò)列，觀察其轉(zhuǎn)錄有的TNFR1 和 DR6靶向蛋白，分析兩組大鼠的miR-223-5p、BMP4陽(yáng)性表達(dá)率;結(jié)果：觀察組隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，受損脊髓段神經(jīng)元的水腫、纖維消失程度加劇，且出現(xiàn)出血性的囊腔，且上述指標(biāo)的嚴(yán)重程度明顯高于對(duì)照組。同時(shí)，兩組大鼠受損脊髓段的TNFR1 、DR和BMP4陽(yáng)性率顯著上述，觀察組的上述率高于對(duì)照組，存在顯著差異（p<0.05）。結(jié)論：minR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR和BMP4與大鼠脊髓損傷程度正相關(guān)，可以作為SD大鼠脊髓損傷的提示指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】脊髓損傷;靶向蛋白;miR-223-5p;BMP4

【中圖分類號(hào)】R651 ? ? ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? ? ?【文章編號(hào)】1672-3783（2020）08-0045-02

脊髓損傷是受損段出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，不能正確傳輸外界刺激信號(hào)。實(shí)驗(yàn)研究顯示：miR-223-5p信號(hào)通路是神經(jīng)信號(hào)傳輸?shù)慕橘|(zhì)[1]，但其與損傷神經(jīng)間的相關(guān)性尚不明確。又有研究顯示，BMP4（transforming growth factor β，TGF-β）參與脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，是受損組織壞死的反應(yīng)，但其參與的程度尚不明確?；谏鲜鲈?，本文以miR-223-5p和BMP4為研究對(duì)象，分析兩者與大鼠脊髓損傷的相關(guān)性。

1.材料與方法

1.1材料

選擇40只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為兩組，每組各20只。兩組大鼠的年齡、體重等方面資料無(wú)顯著差異，可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2脊髓損傷模型制備

兩組大鼠采用不同的制備方式，觀察組先對(duì)大鼠進(jìn)行1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔麻醉，對(duì)其T10棘突位置進(jìn)行切口，分離周圍肌肉。同時(shí)，用直蚊式有齒血管鉗對(duì)棘突和兩側(cè)椎板進(jìn)行破壞，充分暴露硬脊膜，并用重物打擊硬膜囊造成脊髓損傷;對(duì)照組僅進(jìn)行脊髓暴露，但不進(jìn)行重物擊打兩組大鼠制備完成后[2]，進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，人工排尿。

1.3實(shí)驗(yàn)方法和指標(biāo)

兩組大鼠分別采用和PCR染色檢驗(yàn)，對(duì)比大鼠的脊髓損傷程度，以及神經(jīng)元水腫和神經(jīng)纖維消失情況。其中，下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分以傾斜板評(píng)分和改良的Tarlov評(píng)分為主，傾斜板評(píng)分分值為1～5分，分值越高代表受損越嚴(yán)重;Tarlov評(píng)分分值為1～50分，分值越低代表受損越嚴(yán)重。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel軟件進(jìn)行分析。其中，計(jì)量采用x ?±s，計(jì)數(shù)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。p<0.05代表存在顯著差異。

2.結(jié)果

2.1兩組大鼠的下肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分

觀察組的IP評(píng)分和Tarlov評(píng)分均遜于對(duì)照組，存在顯著性差異（p<0.05），結(jié)果如下表所示：

2.2 miR-223-5p、BMP4與損傷程度

觀察組中大鼠的miR-223-5p的與其轉(zhuǎn)化的靶向蛋白，以及BMP4的陽(yáng)性率與脊髓損傷之間存在顯著正相關(guān)（r=2.823，p=0.021），存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.討論

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：脊髓受損后，脊髓灰質(zhì)與白質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元受損程度不同。白質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元損傷主要是由于繼發(fā)損傷所致。又有臨床研究顯示，繼發(fā)性脊髓損傷所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷經(jīng)歷水腫、壞死和凋亡等過(guò)程，BMP4是白質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元凋亡的主要蛋白。在白質(zhì)神經(jīng)元損傷過(guò)程中，分泌大量神經(jīng)影響因子TNFR1、DR6，所以對(duì)影響因子的分析和檢測(cè)，可以判斷損傷的位置和原因，更好地為臨床治療提供幫助[3]。

3.1 脊髓損傷釋放大量miR-223-5p、BMP4

對(duì)照組大鼠脊髓組織相對(duì)比較密集，細(xì)胞核比較大，染色比較淺，且內(nèi)核清晰。大鼠脊髓損傷后12h，出現(xiàn)片狀出血，且呈現(xiàn)壞死性囊腔，神經(jīng)元水腫明顯，組織間隙較大，組織間的膠質(zhì)細(xì)胞溶解，從影像學(xué)證實(shí)大鼠脊髓出現(xiàn)損傷。TNFR1、DR6是miR-223-5p轉(zhuǎn)錄后的靶向蛋白，基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，上述蛋白參與神經(jīng)細(xì)胞的增殖、凋亡和分化，從基因角度證實(shí)大鼠脊髓出現(xiàn)損傷。BMP4屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β范疇，是小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化的反應(yīng)，出現(xiàn)于組織的炎癥反應(yīng)后。脊髓損傷后出現(xiàn)一定的嚴(yán)重，受損組織周圍細(xì)胞壞死，凋亡，釋放大量的BMP4。本文研究結(jié)果顯示，觀察組大鼠的BMP4量顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明脊髓損傷與BMP4有關(guān)。同時(shí)，部分研究結(jié)果顯示，神經(jīng)組織損傷，或者缺血性損傷，會(huì)導(dǎo)致受損組織出現(xiàn)磷酸化，增加BMP4的釋放量。兩組大鼠在12h后，miR-223-5p釋放量增加，導(dǎo)致TNFR1、DR6的陽(yáng)性率提高，而且組織的磷酸化使得BMP的釋放量進(jìn)一步增強(qiáng)。由此可知，大鼠脊髓發(fā)生繼發(fā)性損傷后，TNFR1、DR6和BMP4的釋放量增加，進(jìn)而陽(yáng)性率提高。

3.2 miR-223-5p、BMP4促使損傷加劇

研究結(jié)果顯示，兩組大鼠的3h、6h和12h 后miR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR6， 以及BMP4均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，說(shuō)明大鼠脊髓損傷后，炎癥反應(yīng)逐漸增強(qiáng)。已有研究表明，在神經(jīng)元損傷后，膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡加快，致使miR-223-5p轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，TNFR1、DR6的陽(yáng)性率升高。研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在大鼠脊髓損傷3h時(shí)，觀察組和對(duì)照組的miR-223-5p的表達(dá)增加量差異較小，而在6h、12h時(shí)增加量飆升。同時(shí)，伴隨TNFR1、DR6表達(dá)的增強(qiáng)，BMP的表達(dá)也隨之急劇增加， 初步證實(shí)TNFR1、DR6與BMP4參與脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，與繼發(fā)性脊髓損傷相關(guān)。另外一個(gè)方面，脊髓損傷會(huì)增加周圍組織的磷酸化，使得BMP4的活性受到抑制，使得膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化能力減弱，進(jìn)一步促進(jìn)組織凋亡，增強(qiáng)損傷后的炎癥反應(yīng)。大鼠的脊髓受損后，血液中炎性細(xì)胞數(shù)量激增，而炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生會(huì)產(chǎn)生活氧化物（ROS，reactive oxygen species）和炎性因子，本文研究結(jié)果中TNF-α、IL-1β和BMP4隨著大鼠脊髓損傷的加劇，三者的陽(yáng)性率顯著提高。國(guó)內(nèi)研究結(jié)果顯示，TNF-α、IL-1β是神經(jīng)炎凋亡、脊髓白質(zhì)的主要炎性介質(zhì)，而且TNF-α與BMP4的結(jié)合，可以活化RIP1復(fù)合物參，使得脊髓受損組織出現(xiàn)再灌注血，增加組織內(nèi)的炎性因子量。所以，本研究中，觀察組大眾的miR-223靶向蛋白TNF-α和IL-1β陽(yáng)性率激增。另外，有研究結(jié)果顯示，BMP4是神經(jīng)元組織間膠質(zhì)消失的標(biāo)志物，所以觀察組的BMP4在3h、6h和12h階段量顯著增加，而且在12h的增加量激增，提示隨著損傷的延長(zhǎng)，脊髓中的神經(jīng)元、神經(jīng)纖維消失加快。12h時(shí)出現(xiàn)血液再灌注的問(wèn)題，進(jìn)一步增加組織的炎癥因子量，促使神經(jīng)細(xì)胞消亡，加劇神經(jīng)組織的損傷。

綜上所述，minR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR和BMP4與大鼠脊髓損傷程度正相關(guān)，可以作為SD大鼠脊髓損傷的提示指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1] 滿朝來(lái)， 楊美玲. 體液循環(huán)microRNA的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物工程雜志， 2014， 34（2）： 104-108.

[2] Koudstaal S， Oerlemans MI， Van der Spoel TI， Janssen AW， Hoefer IE， Doevendans PA，Sluijter JP， Chamuleau SA. Necrostatin-1 alleviates reperfusion injury following acutemyocardial infarction in pigs[J]. Eur J Clin Invest . 2015; 45：150-9.

[3] Linkermann A， Br?sen JH， Darding M， Jin MK， Sanz AB， Heller JO， De Zen F， Weinlich R，Ortiz A， Walczak H， Weinberg JM， Green DR， Kunzendorf U， Krautwald S. Twoindependent pathways of regulated necrosis mediate ischemia-reperfusion injury[J].Proc Natl Acad Sci U S A . 2013，22（15）：110：12024-9.

墊江縣技術(shù)研發(fā)與示范應(yīng)用項(xiàng)目，項(xiàng)目名稱：miR-223-5p通過(guò)BMP4調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞分化在脊髓損傷修復(fù)中的研究，項(xiàng)目編號(hào)：djkjxm2018jsyfysfyy031