劉勃興 張志強(qiáng) 史秋梅/河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 071300

1 病料來源

病死澳洲黑雞，由唐山灤南縣某蛋雞養(yǎng)殖場送樣。

2 試驗(yàn)材料

DL2 000 plus DNA Marker，購自中科瑞泰科技有限公司； 2 ×Taq Master Mix，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；檢測用病毒核酸提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增引物合成服務(wù)均由上海生工生物公司完成。

3 禽白血病病毒（ALV）的PCR檢測

剖檢病死雞，無菌采取病死雞肝臟、脾臟等組織，用組織勻漿機(jī)研磨組織，12000 r離心1 min，取上清提取病毒DNA，提取步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測。ALV通用檢測引物為：ALV-F（5 ＇- CGAGAGTGGCTCGCGAGATGG-3 ＇），ALV-R（5 ＇- ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT -3 ＇）。PCR目的條帶大小2400bp。PCR擴(kuò)增體系（20μL）為：2×Taq Master Mix 10μL，上、下游引物各 1μL，模 板 1μL，ddH2O 7μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min；94℃變性45秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠跑膠驗(yàn)證，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

4 結(jié)果

4.1 病死雞臨床及剖檢癥狀

發(fā)病雞為135日齡左右的澳洲黑雞，產(chǎn)蛋停止。臨床剖檢，發(fā)現(xiàn)其脾臟、肝臟明顯腫大，易碎，卵巢糜爛出血。（見圖1）

圖1 病死雞剖檢結(jié)果

4.2 ALV的PCR檢測對病死雞肝臟、脾臟進(jìn)行ALV的PCR檢測，均擴(kuò)增出約為2400bp條帶，與預(yù)期的目的片段大小一致。表明病死雞肝臟、脾臟中均含有ALV（見圖2）。

5 結(jié)論

圖2 ALV的PCR檢測

通過對唐山灤南縣某蛋雞養(yǎng)殖場送檢的病死進(jìn)行臨床剖檢及實(shí)驗(yàn)室診斷，確定該養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的蛋雞患有禽白血病，對該地區(qū)蛋雞白血病的防控提供參考。

6 診斷與防治

目前，未發(fā)現(xiàn)對禽白血病的有效治療方法。國內(nèi)外控制禽白血病的方法為通過對禽白血病的檢測，淘汰檢測陽性雞。通過早期的檢測淘汰攜帶禽白血病病毒雞可減少該病的垂直傳播和接觸傳播的的概率，減少經(jīng)濟(jì)損失。

禽白血病的診斷方法大致可分為3類，分別是病毒的分離鑒定、血清學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法。病毒的分離鑒定通過將血漿、血液、肝臟等器官或泄殖腔分泌物等接種于雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)使病毒增殖，再用PCR、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等方法檢測，該類方法試驗(yàn)周期長，費(fèi)用較高，不適合大量檢測。血清學(xué)檢測方法包括中和試驗(yàn)（NT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）等，血清學(xué)檢測具有特異型強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)較短和可大量檢測的優(yōu)點(diǎn)，但檢測可出現(xiàn)假陽性，檢測試劑費(fèi)用高。分子生物學(xué)檢測方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）。分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有特異性靈敏性高、檢測時(shí)間短、試劑價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，但該類檢測方法對試驗(yàn)要求較高，技術(shù)操作復(fù)雜。通過上述三類檢測方法基本可對禽白血病診斷，對檢測出陽性帶毒雞應(yīng)及時(shí)處理，并應(yīng)定期、多次檢測，了解雞群帶病情況。

禽白血病可在雞群內(nèi)垂直傳播和水平傳播，在防控凈化時(shí)應(yīng)注意該病的流行病學(xué)特征。養(yǎng)殖過程中防止禽白血病在雞群的垂直傳播，做到早診斷早處理，淘汰帶毒種雞、雞蛋、雞雛，凈化雞群；防止雞白血病在雞群的水平傳播，孵育階段對孵育工具定期消毒，育雛時(shí)對雞舍定期消毒，防止飼料與飲水污染，合理集中處理糞便，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高機(jī)體免疫力。

至今還沒有能有效預(yù)防治療禽白血病的疫苗和藥物等，因此，一方面應(yīng)加快禽白血病的診斷試劑的研制，提高檢測的準(zhǔn)確性，縮短檢測時(shí)間，降低檢測費(fèi)用等；另一方面，加快禽白血病預(yù)防和治療藥物的研究，攻克禽白血病的預(yù)防和治療的難關(guān)，保障我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。