李艷麗，邢西遷，劉艷紅，周玉山，莊 敏，肖 誼

（1）昆明市延安醫(yī)院，昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)，云南昆明 650051；2）云南省第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，云南昆明 650021）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種全球范圍內(nèi)常見的呼吸道疾病，全球患病率急劇上升，經(jīng)濟負擔重[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國哮喘患者大約在3 000 萬以上，且有逐年增高的趨勢[2]。氣道上皮細胞在啟動和調(diào)節(jié)氣道的固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用[3]。胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是一種由氣道上皮分泌的細胞因子，大量的研究證實，TSLP 在哮喘中高表達[4]。研究證實，TSLP 通過激活樹突狀細胞誘導(dǎo)CD4+T 細胞向Th2 分化發(fā)育，從而加重哮喘氣道炎癥[5]。RNA 干擾技術(shù)是將外源性雙鏈RNA 引入細胞內(nèi)抑制同源基因表達，不同于傳統(tǒng)的基因敲除，而是通過降解同源序列的靶mRNA 從而抑制基因的表達；該技術(shù)可特異性的沉默致病基因、阻止特定疾病的發(fā)生。因此，筆者構(gòu)建小鼠哮喘模型，檢測小鼠氣道上皮細胞中TSLP mRNA 和蛋白的表達水平；并進一步觀察TSLP siRNA 干預(yù)后對哮喘小鼠氣道炎癥的影響，以期為哮喘的治療提供理論依據(jù)和新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24 只BALB/c 雌性小鼠，鼠齡6～8 周，體重18～22 g，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 實驗材料和試劑

24 只BALB/c 小鼠（雌性，6～8 周齡）購自成都達碩實驗動物有限公司，卵白蛋白（OVA，Ⅳ級）Sigma 公司產(chǎn)品，ELlSA 試劑盒購自深圳晶美生物公司，Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購于Vazyme 公司；引物由上海捷瑞公司合成，RT-PCR 試劑盒購自天根公司，TSLP siRNA 購自SANTA 公司，DAB 顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；Finepointe NAM 系統(tǒng)小鼠無創(chuàng)肺功能儀（BUXCO 公司，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型的建立 24 只清潔級BALB/c 小鼠，體質(zhì)量（18～22）g，分為對照組（Control）、模型組（Model）和模型+TSLP siRNA干預(yù)組（M+TSLP siRNA），每組8 只。模型組于第0、7、14 天腹腔內(nèi)注射OVA-氫氧化鋁混懸液（50 μg OVA+2 mg 氫氧化鋁凝膠混合于200 μL PBS溶液中），在第21、22、23 天使用OVA 溶液（100 ug OVA 溶于40 μL PBS）滴鼻構(gòu)建哮喘模型。TSLP siRNA 干預(yù)組則在第21～23 天激發(fā)前30 min給予腹腔注射TSLP siRNA 125 μL給予干預(yù)。對照組致敏與激發(fā)均以PBS 代替OVA。各組小鼠在末次激發(fā)后24 h 內(nèi)行肺功能檢測測定氣道反應(yīng)性，隨即處死小鼠并取材。所有動物程序均按照“實驗動物福利法”和“實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南”進行[6]。

1.3.2 小鼠氣道反應(yīng)性的測定在最后一次OVA激發(fā)24 h 后進行，4%的戊巴比妥溶液（90 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離暴露氣管，插入套管，并與電腦控制的小動物肺功能儀相連。設(shè)定呼吸機參數(shù)，呼吸頻率150 次/min，潮氣量10 mL/kg，呼氣末正壓為2 cmH2O，接近小鼠自主呼吸時的平均肺容積。每只小鼠依次用PBS 溶液、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL 濃度的 Mch（Methacholine，乙酰甲膽堿）進行激發(fā)，測定氣道阻力的變化。

1.3.3 BALF 的收集及組織標本制備小鼠仰臥位固定麻醉后，氣管插管，1 mL 冰磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗右肺3 次，并回收灌洗液體，約2.5 mL/鼠，離心后取上清液，得到支氣管肺泡灌洗液（BALF），離心收取上清液進一步行ELISA 檢測。打開胸腔，取右肺中葉，4%多聚甲醛固定，待蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色病理檢查，余肺組織-80℃凍存用于RT-qPCR 及Western blot 分析。

1.3.4 RT-qPCR 法檢測TSLP mRNA 的表達水平按照Trizol 試劑說明書進行肺組織總RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄cDNA，在PCR 儀上擴增。應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件進行引物設(shè)計。TSLP:上游引物5'-CGGATGGGGCTAACTTACAA-3'，下游引物：5'-AAATGTTTTGTCGGGGAGTG -3'; β-actin:上游引物5'-AGCCATGTACGTACGTAGCCATCC-3'，下游引物：5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。記錄TSLP 和β-actin 的熒光域值循環(huán)數(shù)（Ct）值，以β-actin 作為內(nèi)參基因，以2-△△CT法計算TSLP mRNA 的相對表達量。

1.3.5 Western blot 檢測肺組織中TSLP 蛋白的表達情況稱取各組小鼠肺組織50 mg，加入RIPA蛋白裂解液500 μL。搖動、離心、取上清液，提取蛋白。將蛋白置于EP 管中，每管50 μg，10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。再用5%脫脂奶4℃室溫封閉過夜，加一抗，水平搖床緩慢搖動2 h，TBS-Tween 洗膜3 次，加入二抗搖床平緩搖動2 h，TBS-Tween 洗膜3 次，ECL 發(fā)光劑在X 線光片上曝光、顯影、定影。用水沖洗，晾干后，用Band-Scan 軟件作灰度掃描分析，以β-actin 蛋白作為內(nèi)參照，對結(jié)果進行分析。應(yīng)用圖像分析軟件分析三組中TSLP 蛋白的灰度值，同時以擴增的β-actin 蛋白的表達強度作為基準，計算相對系數(shù)；表達強度=TSLP 蛋白/β-actin 蛋白的值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用q檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠氣道反應(yīng)性的測定

三組小鼠呼氣阻力基礎(chǔ)值之間無差異，Mch 激發(fā)后，模型組在Mch 劑量為25 mg/mL 和50 mg/mL時，AHR 較對照組增加；在Mch 劑量為25 mg/mL和50 mg/mL 時，使用TSLP siRNA 干預(yù)的小鼠氣道阻力較模型組顯著降低，見圖1。

2.2 成功構(gòu)建哮喘小鼠模型的鑒定

對照組小鼠在造模過程中無飲食、行為、呼吸節(jié)律異常改變；而模型組小鼠則出現(xiàn)煩躁不安、活動減少、呼吸節(jié)律不齊、急促等表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)點頭呼吸和口鼻紫紺表現(xiàn)。肺組織病理切片HE染色顯示（圖2）：對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，粘膜下少量炎癥細胞浸潤；模型組小鼠氣道上皮脫落，粘膜下大量炎性細胞浸潤和腺體增生，肺泡壁明顯增厚，肺泡間隔斷裂，肺泡融合增大，血管及支氣管周圍大量炎性細胞浸潤（圖中箭頭標記處）。與模型組相比，TSLP siRNA 干預(yù)組肺泡壁增厚減輕，肺泡間隔斷裂減少。

圖1 小鼠氣道反應(yīng)性的變化Fig.1 Airway resistance to increasing concentrations of methacholine in mice

圖2 肺組織病理切片HE 染色（10×20）Fig.2 Histopathological changes of lung tissue （HE staining 10×20）

2.3 肺泡灌洗液（BALF）ELISA 檢測結(jié)果

與對照組相比，模型組BALF 中IL-4、IL-5和IL-13 的水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；模型+TSLP siRNA 干預(yù)組BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13 的水平較模型組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

圖3 肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13 ELISA 檢測結(jié)果Fig.3 The concentration of IL-4、IL-5 and IL-13 in BALF by ELISA

2.4 各組小鼠肺組織TSLP mRNA 的表達

對照組與模型+TSLP siRNA 干預(yù)組TSLP 蛋白的表達水平均明顯低于模型組（P<0.01），而模型+TSLP siRNA 干預(yù)組較對照組略高，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖4。

2.5 各組小鼠肺組織TSLP 蛋白的表達

與對照組相比，模型組肺組織中TSLP 表達明顯增高，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.001）；而模型+TSLP siRNA 干預(yù)組TSLP 蛋白水平較模型組明顯下降，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見圖5。

圖4 肺組織TSLP mRNA 的表達Fig.4 Expressions of TSLP mRNA in the three groups

圖5 Western Blot 檢測結(jié)果Fig.5 Expressions of TSLP Protein by Western Blot

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，涉及多種炎癥細胞和氣道結(jié)構(gòu)細胞（氣道上皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞）以及各種細胞因子[7]。目前大量的研究證實[8-9]，氣道炎癥和氣道重塑為哮喘最重要的病理特征。而參與哮喘氣道慢性炎癥的細胞主要為嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞等。實驗中，筆者通過OVA 致敏與激發(fā)的方法建立哮喘小鼠模型，肺組織病理切片結(jié)果與既往報道一致，符合哮喘的病理學(xué)改變[10]：與對照組相比，模型組小鼠氣道上皮脫落，粘膜下大量炎性細胞浸潤和腺體增生，肺泡壁明顯增厚，肺泡間隔斷裂，肺泡融合增大；血管及支氣管周圍大量以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤。

研究表明，氣道上皮細胞在哮喘的病理生理過程中具有重要作用。一方面，它們通過緊密連接形成機械屏障抵御過敏原和其他有害物質(zhì)的損傷，另一方面當氣道上皮細胞受到各種刺激損傷后可釋放多種炎性介質(zhì)和細胞因子（如TSLP、IL-25 和IL-33），參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展。而TSLP 是氣道上皮細胞分泌的一種細胞因子，在氣道上皮受到損傷時釋放[11]。TSLP 對調(diào)節(jié)氣道上皮細胞功能、誘導(dǎo)Th2 免疫應(yīng)答等具有重要作用[12]，且TSLP 可激活髓系樹突狀細胞增強Th2 型免疫應(yīng)答和促進Th2 型炎癥細胞因子的釋放，從而加重炎癥反應(yīng)，在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[13]。在筆者的實驗中，Real-time PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，模型組TSLP mRNA 的表達水平較對照組明顯增高；同時Western blot 結(jié)果顯示模型組中TSLP 蛋白的表達水平明顯高于對照組。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型小鼠TSLP mRNA 表達水平較正常小鼠顯著升高，且TSLP 高水平表達可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠氣道出現(xiàn)超敏反應(yīng)[14]。筆者的研究同樣證實哮喘小鼠氣道上皮中TSLP 表達水平明顯增高。

Zhang 等[15]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用siRNA 沉默CD4+T 細胞的SOCS3 的表達，能減輕哮喘小鼠炎性細胞的浸潤、降低白細胞介素4（IL-4）的水平，從而阻止哮喘的發(fā)展。Th2 型細胞通過釋放白細胞介素5（IL-5）等細胞因子來協(xié)調(diào)氣道過敏性炎癥反應(yīng)。已有研究證實，應(yīng)用TSLP 抗體可明顯降低哮喘氣道炎癥。哮喘病理生理改變中的氣道高反應(yīng)性、粘液分泌過多和氣道重塑，部分是由TSLP 通過其下游的促炎效應(yīng)驅(qū)動的，其中涉及到IL-4、IL-5和IL-13 等細胞因子[16]。基于TSLP 位于炎性級聯(lián)反應(yīng)的頂端，使其成為一個具有吸引力的治療靶點。本研究中采用siRNA 干預(yù)TSLP 基因的表達，觀察其對氣道炎癥的影響。研究結(jié)果顯示：模型組BALF 中Th2 型細胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）的水平明顯增高；而應(yīng)用siRNA 干預(yù)后，TSLP mRNA 和蛋白的水平較模型組明顯下降，同時BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 的水平亦顯著降低。Lee 等[17]的研究證實，應(yīng)用TSLP 阻斷劑可明顯減輕哮喘的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和Th2 型細胞因子的表達水平。以上結(jié)果說明抑制TSLP 基因表達可有效降低哮喘小鼠氣道上皮TSLP 的表達水平，并降低Th2 型細胞因子的表達水平，提示特異性的對TSLP 基因進行抑制可減輕氣道炎癥。TSLP siRNA 對哮喘氣道炎癥的作用還需要進一步的研究，包括利用上皮細胞系進行的體外實驗。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在OVA 誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中TSLP 表達水平明顯增高，而TSLP siRNA干預(yù)可降低哮喘小鼠氣道上皮細胞中TSLP 的表達水平，以及Th2 型細胞因子的表達水平，從而減輕哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性、改善哮喘癥狀?？傊?，TSLP 在哮喘中高表達，并且在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，TSLP 拮抗劑為哮喘治療的新靶點。而應(yīng)用TSLP 阻斷劑的長期安全性和有效性仍需進行臨床研究證實。