雷妍圓 王德森 薛志洪 呂利華 黃少華 章玉蘋

摘要：【目的】尋找草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）致病性昆蟲病原真菌，以豐富廣東省本地的昆蟲病原真菌資源庫，為開展草地貪夜蛾微生物防治提供研究材料?！痉椒ā繉Σ勺詮V東省廣州市增城區(qū)荔城鎮(zhèn)玉米地的感菌草地貪夜蛾幼蟲體表病原真菌進行微生物常規(guī)分離純化，采用形態(tài)學和ITS-rDNA序列分析相結合的方法對病原真菌進行鑒定，通過3種不同培養(yǎng)基（PDA、SMAY和添加草地貪夜蛾蛹殼PDA培養(yǎng)基）測定病原真菌菌落生長速率和產孢量，并采用浸蟲法研究病原真菌對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致病力。【結果】從感菌草地貪夜蛾幼蟲上分離獲得病原真菌，編號GZSF-1，經鑒定為萊氏綠僵菌（Metarhizium rileyi）。培養(yǎng)基類型對菌株GZSF-1菌絲生長和產孢存在顯著影響（P<0.05），菌株在各培養(yǎng)基上的生長速率為0.76～2.10 mm/d，產孢量為0.33×106～21.67×106孢子/mL，其中在添加蛹殼PDA培養(yǎng)基上的生長速度最快且可獲得最大產孢量。菌株GZSF-1接種草地貪夜蛾2齡幼蟲后，隨孢子懸浮液濃度的升高，幼蟲的感病死亡率增加，當濃度達1×109孢子/mL時，幼蟲的致死中時（LT50）為3.030 d，接菌7 d后幼蟲的累計校正死亡率達100.00%。應用Probit模型，得到菌株GZSF-1對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致病力回歸方程 y=-4.426+0.737x，菌株GZSF-1對草地貪夜蛾2齡幼蟲第7 d的致死中濃度（LC50）為1.02×106孢子/mL。【結論】從田間感菌草地貪夜蛾上分離獲得的病原真菌菌株GZSF-1為萊氏綠僵菌，該菌株對草地貪夜蛾幼蟲具有較好的生防潛力，具有進一步研究的價值。

關鍵詞： 萊氏綠僵菌;草地貪夜蛾;鑒定;生物學特性;致病力;廣州市

Abstract：【Objective】The pathogenic fungi against Spodoptera frugiperda were screened to enrich the resource of entomopathogenic fungi in Guangdong for S. frugiperda biocontrol. 【Method】Fungi infected S. frugiperda larvae were collected from corn field in Licheng Town， Zengcheng District， Guangzhou City， Guangdong Province. The strain were isolated by using conventional separation and purification method， the species was identified based on morphological and ITS-rDNA sequence analysis， growth and sporulation of the strain were observed on three different culture media（PDA，SMAY， and PDA medium containing puparium powder）， and the pathogenicity of the strain to S. frugiperda larvae was studied in laboratory by immersing 2nd instar larvae into serial concentrations of conidial suspension. 【Result】The pathogen isolated form the infected larvae was identified as Metarhizium rileyi， numbered as GZSF-1. The type of culture media had significant influence on mycelial growth and sporulation of strain GZSF-1（P<0.05）.? The growth rate of the strain on different media was 0.76-2.10 mm/d， and sporulation was 0.33×106-21.67×106 conidia/mL. The strain GZSF-1 had good adaptability to PDA medium contained puparium powder with the fastest growth rate and largest sporulation. The mortality rates of the 2nd instar larvae caused by infection of M. rileyi strain GZSF-1 increased with the rising of concentration of conidial suspension. When the concentration reached 1×109 conidia/mL， the median lethal time（LT50） was 3.030 d. The corrected accumulative mortality for 2nd instar larvae after 10 d was 100.00%. The regression equation of the pathogenicity of strain GZSF-1 to 2nd instar larvae was y=-4.426+0.737x by using Probit model. The median lethal concentration（LC50） value of strain GZSF-1 to 2nd instar larvae on day 7 was 1.02×106 conidia/mL. 【Conclusion】The pathogen strain GZSF-1 isolated form the infected larvae was identified as M. rileyi. It has potential biocontrol effects against S. frugiperda and worth further research.

Key words： Metarhizium rileyi; Spodoptera frugiperda; identification; biological characteristics; pathogenicity; Guangzhou City

0 引言

【研究意義】草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是聯(lián)合國糧農組織發(fā)出全球預警的重大遷飛性害蟲，其幼蟲具有寄主范圍廣泛、取食能力強等特點，可危害包括禾本科、菊科和豆科在內的300余種植物，尤其對玉米的危害最嚴重（Casmuze et al.，2010;Early et al.，2018;Montezano et al.，2018;姜玉英等，2019;張磊等，2019）。草地貪夜蛾于2019年入侵我國西南、華南等地，至目前發(fā)生區(qū)域已涉及全國26個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），災害形勢嚴峻（姜玉英等，2019;廖永林等，2019;王磊等，2019;楊普云等，2019;羅舉等，2020）。廣東省為草地貪夜蛾的周年繁殖區(qū)域，是草地貪夜蛾入侵我國的北遷蟲源地之一，防控任務艱巨。據最新的2020年1—3月廣東省越冬蟲情調查，在粵東、粵西、粵北及珠三角地區(qū)多個縣（市）的玉米地里均可捕獲一定數(shù)量的草地貪夜蛾卵、幼蟲、蛹和活雄蛾，田間發(fā)生量較高，對糧食生產安全構成長期性威脅（齊國君等，2020）。目前草地貪夜蛾防控主要依賴化學農藥，但過度依賴和濫用農藥易對人、畜和非靶標生物造成傷害，還使害蟲產生抗藥性，增加防治難度（Yu et al.，2003;Ríos-Díez and Saldamando-Benjumea，2011;Carvalho et al.，2013;李永平等，2019）。利用昆蟲病原真菌開展“以菌治蟲”是農業(yè)害蟲生物防治的核心措施之一，也是推動農藥減量控害的關鍵手段。草地貪夜蛾入侵我國的時間較短，對其微生物防治研究起步較晚，調查采集我國草地貪夜蛾昆蟲病原真菌種類并評估其防治潛能，可推動微生物殺蟲劑的研究與利用，對草地貪夜蛾的可持續(xù)防控具有重要作用（Shah and Pell，2003;張禮生和陳紅印，2014;Rivero-Borja et al.，2018;陳萬斌等，2019;張維等，2019）?！厩叭搜芯窟M展】萊氏綠僵菌（Metarhizium rileyi）（原稱萊氏野村菌[Nomuraea rileyi（Farlow） Samson]）在世界范圍內分布廣泛，是侵染草地貪夜蛾及其他夜蛾科害蟲的重要病原真菌（Sanchez-Pe?a，2000;Martins et al.，2005;Fronza et al.，2017;Erika et al.，2018）。據報道，墨西哥、巴西、印度等國家多個地區(qū)的田間調查均發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下被萊氏綠僵菌侵染的草地貪夜蛾幼蟲（Ordó?ez-García et al.，2015;Mallapur et al.，2018;Shylesha et al.，2018;Cruz-Avalos et al.，2019;Sharanabasappa et al.，2019），尤其是3齡幼蟲的感菌率最高（Habib and Patel，1990;Ruiz-Nájera et al.，2013）。一些有生防潛力的菌株，如哥倫比亞的萊氏綠僵菌分離株Nm-07，因其對草地貪夜蛾2齡幼蟲100%的致死率而被選擇用于菌劑研發(fā)（Bosa et al.，2004）。國內利用萊氏綠僵菌防治草地貪夜蛾的研究剛起步，正逐漸顯示出潛在的優(yōu)勢。鄭亞強等（2019）在草地貪夜蛾入侵之初報道了云南省玉米種植區(qū)該蟲感菌幼蟲的發(fā)生，并對萊氏綠僵菌進行了分離鑒定，以高濃度（1.0×108孢子/mL）的萊氏綠僵菌ZYSP19070接種草地貪夜蛾3齡幼蟲，7 d后致死率達100%?！颈狙芯壳腥朦c】目前，從廣東省本地草地貪夜蛾原寄主上分離到病原真菌的報道較少，除程東美等（2019）報道分離出草地貪夜蛾僵蟲主要致病菌為白僵菌外，尚未見其他相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】采用常規(guī)分離法對廣州地區(qū)野外采集的感菌草地貪夜蛾幼蟲體表病原真菌進行分離純化，采用形態(tài)學鑒定和ITS-rDNA序列分析對病原真菌進行鑒定，明確其病原種類，并對病原真菌的培養(yǎng)特性及其對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致病力進行評價，以豐富廣東省本地的昆蟲病原真菌資源庫，為開展草地貪夜蛾微生物防治提供研究材料。

1 材料與方法

1. 1 供試蟲源及病原菌分離培養(yǎng)

草地貪夜蛾幼蟲采集于廣東省廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)廣東省農業(yè)科學院白云基地粵甜28甜玉米（Zea mays L.）植株上，在實驗室用玉米葉和果穗飼養(yǎng)至化蛹，待其羽化產卵后建立實驗室種群作為供試蟲源。室內飼養(yǎng)條件為溫度（28±1）℃，相對濕度60%～90%，光周期L∶D=14 h∶10 h。

昆蟲病原真菌采自廣東省廣州市增城區(qū)荔城鎮(zhèn)玉米地草地貪夜蛾幼蟲僵蟲，將帶菌蟲體置于滅菌培養(yǎng)皿（d=9 cm），在超凈工作臺中用接種針輕輕挑起少量孢子，采用劃線法接種于麥芽糖薩氏瓊脂酵母（SMAY）培養(yǎng)基（麥芽糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸膏2 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1000 mL），于溫度（28±1）℃，光周期L∶D=12 h∶12 h，光照強度3000 lx的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后，挑取少量孢子至新的培養(yǎng)基純化培養(yǎng)15 d，將分離純化的菌株分生孢子置于20%的甘油中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 菌落培養(yǎng)形態(tài)觀察

將分離獲得的菌株分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1000 mL）、SMAY培養(yǎng)基和添加草地貪夜蛾蛹殼的PDA培養(yǎng)基（在PDA內，按每100 mL加入0.4 g草地貪夜蛾蛹殼粉末），各培養(yǎng)基pH均控制在7.0。將培養(yǎng)基置于溫度（28±1）℃、光周期L∶D=12 h∶12 h、光照強度3000 lx的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。采用光學顯微鏡（Axio Scope A1，Zeiss）和掃描電鏡（S-3400N，Hitachi）觀察菌落形態(tài)特征、產孢結構和分生孢子形態(tài)等顯微結構，在電鏡視野下測量分生孢子的長、寬，測量孢子數(shù)為20～30個。

1. 3 菌株分子生物學鑒定

以分離獲得的菌株基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行菌株ITS-rDNA序列PCR擴增。PCR反應體系50 μL：I-5TM 2×High-Fidelity Master Mix 25 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL（10 μmol/L），ddH2O 20 μL。擴增程序：98 ℃預變性2 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序。

1. 4 培養(yǎng)基對菌株生物學特性的影響

參照雷妍圓等（2010）的方法，將分離獲得的菌株分別接種于PDA、SMAY和添加蛹殼PDA培養(yǎng)基平板中心（各培養(yǎng)基量為15 mL/皿），置于溫度（28±1）℃、光周期L∶D=12 h∶12 h、光照強度3000 lx的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個培養(yǎng)基為一個處理，3次重復。采用十字交叉法每5 d定時定向測量菌落直徑，共測量4次，計算生長速率（mm/d）。培養(yǎng)30 d后，用直徑6 mm的滅菌打孔器在菌落中心至邊緣1/2處打取菌塊，浸入裝有10 mL滅菌0.05%吐溫-80溶液的燒杯（50 mL）中，振蕩獲取孢子，點樣血球計數(shù)板，靜置后計數(shù)，計算產孢量（孢子/mL）。

1. 5 菌株對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致病力測定

以滅菌0.05%吐溫-80溶液配制1.00×105、1.00×106、1.00×107、1.00×108和1.00×109孢子/mL共5個濃度梯度的分離菌株孢子懸浮液，每個濃度為一個處理，以滅菌0.05%吐溫-80溶液處理為對照（CK）。采用浸蟲法處理草地貪夜蛾幼蟲，選取個體大小一致的草地貪夜蛾2齡幼蟲，放入不同濃度供試孢子懸浮液浸漬10 s后挑出，置于濾紙上吸去多余水分，移至皿底墊有濕潤濾紙片的培養(yǎng)皿（d=7.5 cm）中集體飼養(yǎng)（5頭/皿），皿內放入新鮮玉米葉供其取食（王道通等，2020）。處理后的幼蟲置于人工氣候箱中飼養(yǎng)[溫度（26±1）℃，相對濕度（80±5）%，光周期L∶D=14 h∶10 h]。每處理30頭幼蟲，3次重復，持續(xù)觀察7 d。從處理后第2 d開始，每天定時記錄幼蟲死亡數(shù)，對死亡幼蟲進行保濕觀察，蟲體表面長出白色菌絲或綠色分生孢子的視為感菌致死。

1. 6 統(tǒng)計分析

對分離獲得的菌株ITS-rDNA測序結果進行編輯，去除序列兩端質量差的堿基，將優(yōu)化好的ITS序列提交到NCBI網站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），通過BLAST程序進行比對，得到與目的菌株具有同源性的多個菌株相應序列，從中下載同源性較高的序列，使用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining method，NJ），運行1000次bootstrap驗證，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Kumar et al.，2004），結合菌株形態(tài)生物學特征，確定菌株的系統(tǒng)分類地位。

試驗數(shù)據經Excel 2013整理后，使用SPSS 20.0進行處理分析，統(tǒng)計各處理幼蟲的累計死亡率和累計校正死亡率。利用Duncans新復極差法對試驗數(shù)據進行差異顯著性分析，采用Probit方法計算致死中時（LT50），求回歸方程及計算致死中濃度（LC50）。

累計死亡率（%）=處理死亡總蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100

累計校正死亡率（%）=（處理累計死亡率-對照累計死亡率）/（1-對照累計死亡率）×100

2 結果與分析

2. 1 菌株的分類鑒定

田間感菌草地貪夜蛾幼蟲發(fā)現(xiàn)于玉米葉片及花穗上，感菌蟲體呈白色或淺青色（圖1-A和圖1-B）。采用常規(guī)分離法從感菌草地貪夜蛾幼蟲分離獲得病原真菌，編號為GZSF-1。將菌株GZSF-1分別接種至不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，該菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落正面白色，呈短絨毛狀凸起，中心至邊緣1/2處有一寬約3 mm的白色環(huán)（圖1-D），背面淡黃色，邊緣至中心1/2處有多條深褐色輻射紋;以SMAY和添加蛹殼PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落正面培養(yǎng)初期呈乳白色，約4～6 d后開始產孢，產孢后菌落變?yōu)榈G色，培養(yǎng)后期孢子層逐漸加厚，形成灰綠色的孢子層（圖1-E和圖1-F）。分生孢子梗直立，著生于營養(yǎng)菌絲，營養(yǎng)菌絲光滑，具分隔，菌絲直徑2～3 μm，未見孢梗束;分生孢子長橢圓形，表面光滑，一端略膨大，一端稍尖細，大小為5.34 μm×1.73 μm（圖1-G），部分呈鏈狀分布（圖1-H），部分脫落后聚集成堆（圖1-I）。

使用PCR擴增目的菌株的ITS-rDNA序列片段，測序結果顯示擴增片段為596 bp，將該序列在GenBank數(shù)據庫中進行BLAST比對，選取相關序列，使用MEGA 7.0將其在NCBI數(shù)據庫中比對得到的序列下載，經ClustalW多重對比并采用Neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2）。由圖2可看出，與菌株GZSF-1的ITS序列同源性最高的為萊氏綠僵菌（Metarhizium rileyi NIPHM MRF-1）（GenBank登錄號MK697304.1），其ITS序列相似性均在99%以上，處于進化樹最小分支，親緣關系最近。結合菌株培養(yǎng)和形態(tài)學鑒定結果，鑒定菌株GZSF-1為萊氏綠僵菌。

2. 2 菌株GZSF-1的培養(yǎng)特性

由表1可知，培養(yǎng)基類型對萊氏綠僵菌菌株GZSF-1的菌絲生長和產孢存在顯著影響。菌株GZSF-1在PDA培養(yǎng)基上生長初期（前10 d）平均生長速率為1.36 mm/d，后期（后10 d）生長稍有加快，為1.79 mm/d;在添加蛹殼PDA培養(yǎng)基上的生長速度最快，生長后期菌落生長速率達2.10 mm/d，顯著高于在其他兩種培養(yǎng)基（P<0.05，下同）上的生長速率;在SMAY培養(yǎng)基上的生長速度最慢，前、后10 d的生長速率僅為0.95和0.76 mm/d，顯著慢于在其他兩種培養(yǎng)基上的生長速率。菌株GZSF-1在添加蛹殼PDA培養(yǎng)基上的產孢量最多，為21.67×106孢子/mL，顯著高于在PDA和SMAY培養(yǎng)基上的產孢量，在PDA培養(yǎng)基上的產孢量最少，僅0.33×106孢子/mL。

2. 3 室內回接菌株GZSF-1的草地貪夜蛾2齡幼蟲感染癥狀

以分離純化的萊氏綠僵菌菌株GZSF-1接種草地貪夜蛾2齡幼蟲，在感菌初期，幼蟲取食行為、蟲體外部形態(tài)與健康幼蟲無差別;接種后第2 d，幼蟲取食明顯減少或停止取食，行動遲緩;接種后第4 d開始出現(xiàn)感染致死個體，感菌幼蟲體表菌絲增多，腹末開始長出白色菌絲和少量淡綠色分生孢子;接種9 d后幼蟲體表覆蓋菌絲和灰綠色分生孢子（圖1-C），感染癥狀與田間病癥一致。

2. 4 菌株GZSF-1對草地貪夜蛾幼蟲的致病力

由圖3可知，隨著萊氏綠僵菌菌株GZSF-1孢子濃度的增加和處理時間的推移，草地貪夜蛾2齡幼蟲的累計死亡率不斷升高，接種后7 d，各濃度下幼蟲的累計死亡率皆達最高值，其中以最高濃度孢子懸浮液（1.00×109孢子/mL）處理后幼蟲的累計死亡率最高，達100.00%;孢子濃度為1.00×107、1.00×108和1.00×109孢子/mL時，分別在第6、4和4 d出現(xiàn)半數(shù)以上試蟲死亡;孢子濃度為1.00×105和1.00×106孢子/mL時，幼蟲累計死亡率均低于50.00%。

從表2可看出，萊氏綠僵菌菌株GZSF-1對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致病力存在時間—劑量效應，隨孢子懸浮液濃度的增加，幼蟲的LT50縮短;在濃度1.00×107～1.00×109孢子/mL內，幼蟲LT50從5.046 d降至3.030 d;當濃度為1.00×105和1.00×106孢子/mL時，幼蟲的最終死亡率低于50.00%，因此無法計算LT50值。應用Probit模型，得到菌株GZSF-1對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致病力回歸方程 y=-4.426+0.737x，計算菌株GZSF-1處理的草地貪夜蛾2齡幼蟲第7 d的LC50為1.02×106孢子/mL，95%置信區(qū)間為6.13×105～1.62×106孢子/mL。

3 討論

研究昆蟲病原真菌的最終目標是應用于農業(yè)害蟲防治，而優(yōu)良菌株的獲得是第一步。本研究從田間采集的感菌草地貪夜蛾上分離獲得一株對草地貪夜蛾具有致病性的病原真菌菌株GZSF-1，根據該菌株培養(yǎng)形態(tài)特征及ITS序列比對分析，鑒定其為萊氏綠僵菌。菌株GZSF-1對草地貪夜蛾2齡幼蟲表現(xiàn)出較強的致病力，具有較高的致死率和較短的致死中時，高濃度（1.00×109孢子/mL）孢子懸浮液侵染下致死率達100.00%，LT50為3.030 d，與以往報道的草地貪夜蛾病原真菌相似，主要對低齡幼蟲有一定的防治效果（García et al.，2011; Thomazoni et al.，2014; 鄭亞強等，2019; Akutse et al.，2019; 雷妍圓等，2020）。相對于鄭亞強等（2019）報道的云南曲靖地區(qū)一株萊氏綠僵菌ZYSP19070對草地貪夜蛾3齡幼蟲100%的致死率（1.0×108孢子/mL），本研究試蟲的蟲齡較小且孢子濃度稍高。值得關注的是，菌株GZSF-1和ZYSP19070的原始寄主皆為草地貪夜蛾，田間也觀察到該菌引起自然流行疾病，但相較于國內已報道的其他種類病原真菌的室內防效，萊氏綠僵菌對草地貪夜蛾的致病力不如非原寄主上分離的菌株（雷妍圓等，2020），其原因可能是多方面的，還需要進一步探究。

萊氏綠僵菌由于其生長繁殖受諸多因素影響，加之其產孢所需營養(yǎng)條件苛刻（Edelstein et al.，2004;楊新軍等，2007;杜廣祖等，2020），迄今為止未有商業(yè)化制劑開發(fā)。萊氏綠僵菌在培養(yǎng)基上初期生長為酵母狀，后期向菌絲狀轉換。培養(yǎng)基若以單糖作為碳源，則主要進行繁殖生長并產生大量分生孢子;以寡糖和多糖作為碳源，則主要進行營養(yǎng)生長產生大量菌絲。有研究表明，適宜萊氏綠僵菌菌落生長的最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是水解酪蛋白（孔瓊等，2010）;另有觀點認為，適宜菌落生長的最佳碳源和氮源分別是葡萄糖和酵母浸膏（彭小東等，2013）;最有利于產孢的碳源是葡萄糖（孔瓊等，2010;彭小東等，2013;楊淑儀等，2016）。從本研究結果來看，萊氏綠僵菌在不同培養(yǎng)基上的生長狀況存在較大差異。菌株GZSF-1在PDA培養(yǎng)基上生長較緩慢，培養(yǎng)30 d菌落仍以菌絲生長為主，產孢量低。在SMAY培養(yǎng)基上菌株產孢快，接菌后僅4 d肉眼可見菌落產生綠色孢子，但生長速度極其緩慢，說明對菌株GZSF-1而言，以麥芽糖作為碳源雖然促進了產孢，但不能滿足菌落擴展和菌絲生長的要求。綜合生長速率和產孢量2個指標來看，添加蛹殼PDA培養(yǎng)基既適合菌株GZSF-1的營養(yǎng)生長又適合其產孢，可能是添加了原寄主昆蟲營養(yǎng)成分所致。萊氏綠僵菌對營養(yǎng)成分要求極高，且營養(yǎng)生長和生殖生長并不同步，這在本研究3種培養(yǎng)基上得到進一步印證。由于不同地理來源的菌株具有一定的生理差異，要開發(fā)利用該菌，還需針對其營養(yǎng)特異性需求進行最適培養(yǎng)基的后續(xù)研究。

雖然本研究從野外罹病蟲體上分離獲得一株有應用價值的病原真菌，但并不意味著具有無限的使用價值。從蟲尸上分離的野生菌株多為異核體，在培養(yǎng)基中最初由于營養(yǎng)豐富，生長形成多量孢子，當營養(yǎng)大量消耗后，菌種常形成能忍耐貧瘠環(huán)境的次生菌絲體，這些次生菌絲體為菌絲分化出來的菌絲型同核體，轉管時如果挑取了這些次生菌絲，就會形成產孢量降低的衰退菌種，進而導致對目標害蟲的致病力明顯下降，影響生防效果。從長遠利用的角度，應通過控制菌種轉管次數(shù)來保持菌株毒力及控制菌株變異。此外，對菌株進行室內培養(yǎng)時，除了選擇適宜的培養(yǎng)基配方避免菌種退化外，還應給予合適的溫濕度、光照時間和pH等條件，以保持菌株的穩(wěn)定性（李鋒，2002; 孔瓊等，2010; 崔筱，2012）。從菌株分離、毒力保持到利用菌劑在田間環(huán)境中進行害蟲防治，仍然面臨著諸多問題。萊氏綠僵菌菌株GZSF-1在自然條件下可引起昆蟲的田間流行病，而在自然條件下通常是多種病原微生物共存的狀態(tài)，受多種生物及非生物因素的影響，本研究在室內環(huán)境下僅從單一菌株進行致病力評價，并未考慮多種致病性病原微生物間的疊加效應。雖然萊氏綠僵菌菌株GZSF-1對草地貪夜蛾幼蟲具有較強的致病力，說明其在室內條件合適時可起到明顯作用，但在實際防治中是否適應復雜的自然環(huán)境，以及如何挖掘菌株本身的潛力去適應外界條件，仍有待進一步探究。

4 結論

萊氏綠僵菌菌株GZSF-1對草地貪夜蛾幼蟲具有較好的生防潛力，具有進一步研究的價值，但其產孢培養(yǎng)條件較苛刻，且適合在害蟲低齡期應用。

參考文獻：

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（責任編輯 麻小燕）