★ 鄭曉艷 郭月麗（漳州衛(wèi)生職業(yè)學院 福建 漳州 363000）

金線蓮為蘭科開唇蘭屬（Anoectochilus roxburghii（wall.）Lindl）植物，新鮮或干燥全草入藥［1］，全世界品種超過35種，性喜陰涼、潮濕，大致分布于印度、喜馬拉雅山、東南亞各地，野生植株多生長于人跡罕至的原始生態(tài)的陰濕森林和草叢中。金線蓮株高20-30厘米，葉表面墨綠色，鑲嵌以優(yōu)美的金黃或黃白色條紋，因為被稱作“金線蓮”。它在民間使用范圍較廣，素有“藥王”“金草”“神藥”等美稱。歸肺、肝、腎、膀胱經(jīng)，性平，味甘、淡，具有清熱涼血、祛風利濕、解毒、止痛、鎮(zhèn)咳等功效［2］。金線蓮臨床上常用于肝炎、支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、小兒急驚風等疾病的治療［3］。金線蓮的主要化學成分，包括有黃酮、多糖、多酚、揮發(fā)油、有機酸、甾體、生物堿等［4］。本課題組對金線蓮的多糖、總黃酮、多酚提取工藝進行了一系列研究，本文闡述了Box-Benhnken設計-響應面法優(yōu)化金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝研究。

本研究運用Box-Behnken中心組合設計優(yōu)化金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝，以沒食子酸的提取率為指標，選取提取溫度、超聲時間、料液比和乙醇濃度的四因素三水平的實驗模型，建立回歸方程，以響應面分析法（RSM）［5-6］對試驗結(jié)果進行分析，為進一步研究其質(zhì)量標準、藥理活性、作用機制提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超聲波清洗儀（型號：KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（型號：T6，北京普析通用儀器有限責任公司公司）；電子分析天平（型號：BS110S/110g，德國塞多利斯有限公司）。

1.2 材料 沒食子酸標準品（中國食品藥品檢定研 究 院，LOT NUMBER：PR190325-11）；Folin-Ciocalteus試劑（三明市三圓化學試劑有限公司，批號：2018080709）；乙醇（三明市三圓化學試劑有限公司，批號：2018030109）所用試劑均為分析純。金線蓮（購于廈門涌泉科技有限公司，經(jīng)三明市食品藥品檢驗鑒定研究院中藥室高忠坂中藥師鑒定為正品）

2 方法

2.1 金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝 準確稱取5.0g的干燥的金線蓮樣品置于具塞錐形瓶中，按料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在一定的提取溫度超聲處理一定時間，冷卻至室溫，稱重，加乙醇溶液補足減失重量，過濾，收集續(xù)濾液測定其多酚提取量。

2.2 多酚含量測定

2.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取沒食子酸標準品0.100 g至100 mL容量瓶，乙醇定容至刻度線，得到1mg/mL沒食子酸標準儲備液。精密量取1 mL沒食子酸標準儲備液，乙醇稀釋至100 μg/mL的沒食子酸標準液。分別量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的沒食子酸標準液，按1∶9比例加入Folin-Ciocalteus試劑［7］，再加乙醇使得終體積為2.5 mL。搖勻振蕩3min后加入1%Na2CO3溶液1.5 mL，室溫下避光靜置1 h，于760 nm波長測定其吸光度，以沒食子酸含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=21.786X+0.0003，r=0.9991。

2.2.2 金線蓮中多酚提取量的計算［8］精密吸取樣品溶液0.5 mL，按1∶9比例加入Folin-Ciocalteus試劑，搖勻振蕩3 min后加入1.5 mL1%Na2CO3溶液，室溫下避光靜置1 h，以乙醇溶液為參比液，于760 nm波長測定其吸光度。按下式計算樣品中多酚的提取量：

多酚提取量（mg/g）=C×D/m

式中，C為回歸方程計算得到的沒食子酸含量（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；m為稱取金線蓮樣品的質(zhì)量（g）。

2.3 單因素實驗 根據(jù)文獻報道和預實驗結(jié)果，分別考察提取溫度、超聲時間、料液比和乙醇濃度等4個單因素對金線蓮中多酚提取量的影響。

2.3.1 提取溫度對多酚提取量的影響 稱取干燥的金線蓮樣品，按1∶40料液比加入體積分數(shù)為30%的乙醇溶液，分別于提取溫度20、30、40、50、60、70℃超聲提取60min，測定提取液中多酚提取量。

2.3.2 超聲時間對多酚提取量的影響 稱取干燥的金線蓮樣品，按1∶40料液比加入體積分數(shù)為30%的乙醇溶液，分別超聲提取20、40、60、80、100、120 min，設定提取溫度為50℃，測定提取液中多酚提取量。

2.3.3 料液比對多酚提取量的影響 稱取干燥的金線蓮樣品，分別以料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶45加入體積分數(shù)為30%的乙醇溶液，設定提取溫度為50℃，超聲提取60 min，測定其提取液中多酚提取量。

2.3.4 乙醇濃度對多酚提取量的影響 稱取干燥的金線蓮樣品，按1∶40料液比加入體積分數(shù)分別為0%、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，設定提取溫度為50℃，超聲提取60 min，測定其提取液中多酚提取量。

2.4 響應面試驗設計 按照Box-Behnken試驗設計原理，在單因素實驗的基礎上，選取提取溫度（X1）、超聲時間（X2）、料液比（X3）和乙醇濃度（X4）為因素，金線蓮中沒食子酸提取率為響應值（Y），設計四因素三水平的響應面試驗。試驗因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平表

2.5 驗證實驗 稱取干燥的金線蓮藥材3份，按照最佳工藝條件進行提取，按照“2.1項金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝”，按“2.2多酚含量測定”項測定金線蓮中多酚含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗結(jié)果

3.1.1 提取溫度對多酚提取量的影響 見圖1，結(jié)果顯示，金線蓮中多酚提取量隨著提取溫度升高有一定程度的增加，當提取溫度為50℃時，其提取量最大；之后提取量逐漸下降。因此，選擇提取溫度設定為50℃。

圖1 提取溫度對金線蓮中多酚提取量的影響

3.1.2 超聲時間對多酚提取量的影響 見圖2，結(jié)果顯示超聲時間較短時，金線蓮中多酚提取量較小，可能時間較短不利于金線蓮中多酚的提取。隨著超聲時間的增加，多酚提取量增加；當時間為60 min時，提取效果最好。

圖2 超聲時間對金線蓮中多酚提取量的影響

3.1.3 料液比對多酚提取量的影響 見圖3，結(jié)果顯示低濃度的料液比可能使金線蓮中多酚提取不充分，提取量較??；隨著料液比的增加，多酚的提取量逐漸增加，當料液比為1∶40時，提取量最大。

圖3 料液比對金線蓮中多酚提取量的影響

3.1.4 乙醇濃度對多酚提取量的影響 見圖4，結(jié)果顯示不同體積分數(shù)的乙醇對多酚的提取有不同程度的影響；體積分數(shù)為30%的乙醇濃度對金線蓮中多酚有較好的提取量。

圖4 乙醇體積分數(shù)對金線蓮中多酚提取量的影響

3.2 響應面實驗結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合設計原理，采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件進行設計，實驗設計方案與結(jié)果見表2。

表2 金線蓮中多酚提取響應面試驗設計及結(jié)果

（續(xù)表）

對上表中金線蓮中多酚提取率（Y）及三個因素X1、X2、X3和X4的數(shù)值由Design Expert 8.0.6 軟件進行二次回歸模型擬合，回歸分析結(jié)果分別見表3。

表3 金線蓮中多酚（Y）模型的顯著性檢驗及方差分析

對表3實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到的二元多項回歸方程為：

R=5.251-0.132 8A-0.062 4B+0.123 7C-0.055 8D-0.000 683AB-0.000 623AC+0.000 181AD+0.001 56B C+0.000 359BD-0.000 033 8CD+0.001 97A2+0.000 279B2-0.002 35C2+0.000 586D2

回歸方程中個變量對響應值影響的顯著性用F 檢驗來判定，概率P值小于0.05為有顯著性差異，小于0.01為有極顯著性差異。由表3分析結(jié)果看，整體模型的P＜0.05，表明該二次方程模型顯著。而且方程的失擬項不顯著（P＞0.05），說明非試驗因素對試驗結(jié)果的影響不大，可用于金線蓮中多酚提取實驗預測。因素B，D，BC，C2，D2為顯著影響因素，影響大小順序為：超聲時間＞乙醇濃度＞提取溫度＞料液比。兩兩因素之間的交互作用中，超聲時間和料液比的交互作用對金線蓮中多酚提取效果影響顯著。金線蓮中多酚提取的等高線圖與響應面3D圖譜見圖5。

圖5 提取時間與料液比對金線蓮中多酚的響應面及等高線圖

由結(jié)果可知，模型的校正決定系數(shù)RAdj2為0.991 0，表明此模型能解釋99.10% 響應值的變化，即此模型與數(shù)據(jù)擬合度較高，實驗誤差影響較小。說明應用響應面法優(yōu)化的金線蓮中多酚提取工藝準確可靠。

3.3 最佳提取工藝 根據(jù)Expert 8.0.6軟件分析結(jié)果，金線蓮中多酚的最佳提取工藝為：提取溫度42.51℃，超聲超聲時間72.14 min，料液比為1∶40.02，乙醇濃度為49.77%，此條件下金線蓮中多酚提取率預測值為2.92 mg/g。

3.4 驗證實驗 為確保該工藝的穩(wěn)定性與合理性，根據(jù)響應面法得出的最佳提取工藝條件進行驗證（n=3），按照2.1項方法制備供試品溶液，測定金線蓮中多酚含量。為方便實驗具體操作，將提取溫度設定為43℃，超聲超聲時間72min，料液比為1∶40，乙醇濃度為50%。實際測得金線蓮中多酚平均提取量為2.89 mg/g，與理論預測值（2.92 mg/g）相比無顯著性差異（P＞0.05）。因此，采用Box-Benhnken的中心組合試驗設計優(yōu)化的金線蓮中多酚提取工藝條件穩(wěn)定可行，準確可靠。

4 小結(jié)與討論

（1）本研究采用響應面法［9］（Design-Expert軟件）考察金線蓮中多酚的提取工藝，并且根據(jù)二次方程模型分別做出了試驗因素間交互作用的三維立體響應曲面和等高線圖。結(jié)果顯示，二次方程的模擬回歸差異顯著，失擬項不顯著，表明實驗建立的二次回歸方程能較好地反映考察因素與響應值之間的關系，實驗設計合理。

（2）本實驗首先通過單因素試驗分析不同因素對金線蓮中多酚提取量的影響，確定了合適的提取條件；再根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，以金線蓮中多酚提取量為響應值，提取溫度（X1）、超聲時間（X2）、料液比（X3）和乙醇濃度（X4）為因素為影響因素設計的響應面分析實驗。通過對響應值結(jié)果分析，獲得金線蓮中多酚最佳提取工藝為：提取溫度43℃，超聲超聲時間72 min，料液比為1∶40，乙醇濃度為50%。通過驗證實驗，與模型預測值基本相符，證明了該工藝的可行性。

（3）超聲輔助提取金線蓮多酚工藝操作簡單，提取時間較短；超聲波能較好地擊破中藥材的細胞壁，有利于有效成分的溶出；提取過程化學試劑使用量較少，減少試劑的污染；即具有高效、省時、綠色環(huán)保等優(yōu)點。該提取工藝可為金線蓮多酚的進一步開發(fā)利用研究提供科學依據(jù)，具有良好的應用前景。