王建霞，郭洪偉，劉一涵，田云剛，李 明，畢紹文，魏 華，2

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首416000；2.湖南省土家醫(yī)藥研究中心，湖南吉首416000；3.曲靖市沾益區(qū)萬遠中藥材種植農(nóng)民專業(yè)合作社，云南曲靖655000)

輪鐘花(Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz)，別名野靈果、肉算盤等，系桔?？?Campanulaceae)輪鐘花屬(Cyclocodon)多年生草本植物，根可入藥，無毒，有益氣補虛、祛瘀止痛之效[1-2].現(xiàn)輪鐘花不斷得到開發(fā)利用，在云南曲靖、湘西和四川等地開始人工種植，以其果實銷售于市場.輪鐘花果實可食用，成熟時紫黑色，漿果球狀，富含原花青素、果膠和多糖等，具有較強的抗氧化作用[3-6]，可作為飲料和休閑食品的原材料，具較好的發(fā)展空間.輪鐘花化學(xué)成分研究基礎(chǔ)薄弱，僅試劑反應(yīng)顯示果實中主要含糖類、生物堿、黃酮、酚類、甾體、蒽醌類、三萜類和有機酸[7]，亟需深入研究.而揮發(fā)性成分的研究對果實的風(fēng)味品質(zhì)評價十分重要，因此，本研究選擇水蒸氣蒸餾法、索式提取法及超聲輔助萃取法提取輪鐘花果實揮發(fā)性成分，采用GC-MS分析技術(shù)，并結(jié)合保留指數(shù)(Retention index，RI)定性分析果實的揮發(fā)性成分，以期為輪鐘花果實研究分析和深度開發(fā)利用提供參考.

1 儀器與材料

島津GCMS-QP2010(日本島津公司)；步琪Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)；中藥材粉粹機(永康市鉑歐五金制品有限公司)；梅特勒-托利多LE204E分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；昆山舒美超聲儀KQ-250DE(昆山市超聲儀器有限公司)；KDM型調(diào)溫電熱套 (山東鄄城光明儀器有限公司).

正構(gòu)烷烴混合對照品C7-C40(產(chǎn)品編號:CDAA-M-690038-HC-1 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司)；蒸餾水；正己烷、石油醚(沸程30～60℃)、石油醚(沸程60～90℃)(天津市富宇精細化工有限公司)；無水硫酸鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；所用試劑為分析純.

輪鐘花于2018年12月采自云南省曲靖市沾益區(qū)炎方鄉(xiāng)小古山村，由畢邵文先生提供，經(jīng)吉首大學(xué)張代貴教授鑒定為桔?？戚嗙娀▽僦参镙嗙娀–yclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz的果實，憑證標本(JIU.WU20181201)存于湖南省土家醫(yī)藥研究中心.果實于烘箱45℃烘干，粉碎后，過二號篩備用.

2 方法

2.1 水蒸氣蒸餾法提取

準確稱量輪鐘花果實粉末10 g置1 000 mL圓底蒸餾瓶中，加入300 mL蒸餾水和玻璃珠數(shù)粒，隔夜浸泡.連續(xù)提取8 h至揮發(fā)油量不再增加后，收集餾液，置于分液漏斗，使用正己烷萃取3次，萃取液加適量無水硫酸鈉脫水后，40℃減壓濃縮，得少許貼于瓶壁上的淡色物質(zhì)，精密稱重，計算輪鐘花果實得油率.

2.2 索式提取法提取

準確稱量輪鐘花果實粉末10 g置濾紙筒，包實放入索式提取管中，提取管上接冷凝管，下接裝有100 mL石油醚(沸程30～60℃)的250 mL三角瓶.置于40℃水浴鍋回流提取4 h，提取完將三角瓶中收集液40℃減壓濃縮，得少許淺黃色油狀物，精密稱重，計算輪鐘花果實得油率.

2.3 超聲輔助萃取法提取

準確稱量輪鐘花果實粉末10 g置250 mL三角瓶中，按料液比1∶10加入石油醚(沸程60-90℃)，超聲頻率40 kHz，超聲功率250 W，于40℃超聲儀內(nèi)超聲30 min，提取2次.完成后抽濾收集濾液，于40℃減壓濃縮，得少許淺黃色油狀物，精密稱重，計算輪鐘花果實得油率.

2.4 GC-MS分析條件

色譜條件:SH-Rtx-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純氦氣(純度 ＞ 99.99%)，載氣流量 1 mL/min，進樣量 1.0 μL，進樣口溫度250.0℃，分流比20∶1，程序升溫為:初始溫度為100.0℃，以5.00℃/min的速率升溫至200℃，保持5 min，再以6℃/min的速率升溫至280℃，保持20 min；溶劑延遲時間為3 min.質(zhì)譜條件:離子源為EI源，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為m/z50～600 amu，離子源溫度為230℃.

2.5 保留指數(shù)的測定

取正構(gòu)烷烴混合對照品(C7-C40)0.1 mL溶1 mL正己烷中，取適量過膜備用，按照2.4項的色譜條件進行分析，記錄保留時間，運用單一線性升溫公式(1)來計算各待測化合物的保留指數(shù)RI[8].

式中，RI代表保留指數(shù)，tr代表保留時間，x表示待分析的化合物，n和n+1分別表示正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)，且tr(n)＜tr(x)＜tr(n+1).

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油得油率

水蒸氣蒸餾法、索氏提取法、超聲輔助萃取法提取長葉輪鐘草果實揮發(fā)油的得率(w/w)分別是1.24%、4.61%和5.43%.

3.2 GC-MS結(jié)合保留指數(shù)分析結(jié)果

按上述GC-MS條件測定，3種方法提取輪鐘花果實揮發(fā)性成分的總離子流圖(TIC圖)如圖1所示，采用峰面積歸一化法分析，得出各組分在樣品中的質(zhì)量分數(shù).依據(jù)NIST14s.lib標準譜庫檢索，人工譜庫解析，從匹配度、質(zhì)譜圖相似度等方面進行比較，取上述公式(1)計算待測組分的RI，并與網(wǎng)站(http://webbook.nist.gov/chemistry/)和NIST14s.lib標準譜庫中RI*文獻值對比進行定性，選出最適匹配化合物.

圖1 輪鐘花果實揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile constituents from fruits of Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz

輪鐘花果實的揮發(fā)性成分以酸類、烴類、酯類和醇類為主，如表1、圖2所示.果實揮發(fā)性成分共確定64種化合物，三種提取方法檢測到共同成分為9種.其中，水蒸氣蒸餾法、索式提取法和超聲輔助萃取法各確定31、38和34種化合物，揮發(fā)性成分各占樣品總質(zhì)量分數(shù)的88.74%、97.03%和99.14%.

由表1可知，果實水蒸氣蒸餾提取物揮發(fā)性組分中占樣品質(zhì)量分數(shù)在3%以上的有6種，共占樣品總質(zhì)量分數(shù)的53.18%.十九烷(20.09%)質(zhì)量分數(shù)占比最高，其次為正二十一烷(19.67%)、2，6，10，15-tetramethylheptadecane(3.88%)、三十一烷(3.27%)、Butyl 9，12，15-octadecatrienoate(3.19%)和二十五烷(3.08%).索氏提取物揮發(fā)性組分中占樣品質(zhì)量在3%以上的有4種，共占樣品總質(zhì)量分數(shù)的66.86%.亞油酸(45.13%)質(zhì)量分數(shù)占比最高，其次為棕櫚酸(8.67%)、反油酸(7.15%)和 Chondrillasterol(5.91%).超聲提取物揮發(fā)性組分中占樣品質(zhì)量分數(shù)在3%以上的有5種，共占樣品總質(zhì)量分數(shù)的79.89%.(Z)-18-Octadec-9-enolide(28.73%)質(zhì)量分數(shù)占比最高，其次為亞油酸(24.59%)、棕櫚酸(10.50%)、油酸(8.74%)和植物甾醇(7.33%).

表1 輪鐘花果實揮發(fā)性成分Table 1 Volatile constituents in fruits of Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz

注:RI通過實驗結(jié)果計算獲得；RI*通過http://webbook.nist.gov/chemistry/或NIST14s.lib譜庫檢索獲得；“-”代表無或未檢出.Note:RI is obtained by the calculation of experiment；RI*is obtained by http://webbook.nist.gov/chemistry/or NIST14s.lib；“ -” represents no or not detected.

圖2 輪鐘花果實揮發(fā)性成分類別比較Fig.2 Classification comparison of volatile components from fruits of Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz

4 討論與結(jié)論

GC-MS與保留指數(shù)配合定性揮發(fā)性成分已是比較認可的方法，其結(jié)果具有一定的全面性和準確性，在食品、煙草、香精香料等中廣泛應(yīng)用[9-12].水蒸氣蒸餾法、索式提取法和超聲輔助萃取法因提取原理不一樣，所提取出揮發(fā)性成分得量和種類也有較大不同，3種方法相互結(jié)合，可較充分提取出樣品中的揮發(fā)性成分.果實中含大量的亞油酸，索氏提取法和超聲輔助萃取法提取出亞油酸較多，分別為45.13%和24.59%，而水蒸氣蒸餾法卻檢測到亞油酸較少，為0.91%，可能是提取原理不同或?qū)嶒灢僮鞯仍斐?亞油酸作為人體必需脂肪酸和重要的多不飽和脂肪酸，日常需求極高，具有抗粥狀動脈硬化和增強肌體免疫能力等作用[13，14].

筆者測得輪鐘花果實的揮發(fā)性成分與蔣寒林等[15]報道的輪鐘花果實揮發(fā)性成分有一定的差異，文獻所報道的果實揮發(fā)性成分主要為烴類、酸類、酯類和醇類，基本與本研究結(jié)果相符；同樣是使用3種相同的提取方法，兩者檢測得出相同成分僅20余種，且成分的種類和含量也有較大不同，究其原因可能是果實的采摘時間、保存方式、分析儀器和檢索方式等不同所致.

本研究選用3種提取方法，采用GC-MS分析，并結(jié)合保留指數(shù)定性分析輪鐘花果實揮發(fā)性成分.鑒定出果實64種揮發(fā)性成分，以酸類、烴類、酯類和醇類為主，研究結(jié)果可為輪鐘花果實進一步開發(fā)利用提供依據(jù).